次氯酸荧光探针的研究进展*

李泽强，盛家荣

(南宁师范大学 化学与材料学院，广西 南宁 530100)

0 引言

活性氧物质(Reactive Oxygen Species，ROS)是指机体内或者自然环境中由氧组成,含氧并且性质活泼的物质的总称。活性氧物质包含次氯酸、过氧化氢、超氧化物自由基阴离子、羟基自由基[1-2]。活性氧因氧化导致机体的生理发生变化，进而产生多种疾病，如神经退行性疾病或癌症等[3]。在生理条件下，细胞内的ROS水平经过精细调节，在正常细胞信号转导、细胞周期、基因表达和体内平衡过程中充当信使。当ROS过量时，会引发许多有害事件：ROS诱导细胞中的氧化应激，随后导致细胞内的生物大分子(如核酸，膜脂和细胞蛋白)被破坏，这些生物分子的氧化损伤会触发细胞凋亡，与衰老，多种疾病，癌症和神经退行性疾病以及糖尿病和炎症的发病机理密切相关。在近年的检测中，荧光探针作为一种新型的检测方法受到了众多学者的关注。在荧光检测中，通过把化学信号转化为光信号，进而实现了对生物体内活性氧稳态检测。

1 HClO

HClO是一种特殊的活性氧，在抵抗病原体入侵和维持细胞氧化还原平衡等生理过程中发挥着重要作用。HClO是一种强氧化剂,能杀死水里的病菌，一般可作为漂白剂或消毒剂用于家庭清洁、饮用水和游泳池中[5]。一般来说，HClO由过氧化氢和氯离子在过氧化酶的催化下反应生成，HClO的酸度系数为7.46，在pH=7.4生理条件下，HClO处在平衡的状态。在人体内，HClO通过中性粒细胞中的髓过氧化物酶过氧化氢和氯离子的系统产生。一旦病原体和细菌侵入人体内，HClO作为人体内免疫防御系统中的一部分就能够对其发动攻击，在生理和病理过程中起着非常重要的作用[6]。另外，HClO还能够与生物中的DNA、脂肪酸、蛋白质、胆固醇等多个生物分子发生反应[7]。尽管HClO能够保护机体健康，但是一旦生物体内的HClO含量过高或分布异常，就会产生氧化应激反应，从而产生一系列的疾病，比如说肾脏疾病、神经退行性病变等等[8]。

2 荧光探针

活性物质对生物体内的物质正常运转与循环致关重要。在活性物质浓度平衡且正常的状态下，能够对生物体内的运转产生积极的影响，但活性物质的含量出现异常，将会导致生物体内的平衡受到破坏，发生生理紊乱，进而产生一系列的生理疾病。

荧光探针主要是指某些化合物可以与待检测物发生反应，进而使荧光发生变化来确定待测物质。荧光探针法在生物学和临床医学的应用已较为成熟，是生物体内活性物质检测的重要手段。在荧光探针能将化学信号转化为光信号。荧光探针法比临床医学上的生物体内活性物质检测的液相色谱法、质谱法[9]有更高的检出率，并且选择性和生物相容性更好[10]。因此,近些年来，采用荧光探针法检测活性物质成为生物体检测的主要手段，也是该领域的研究主方向。

2.1 荧光探针的识别

荧光探针的设计所采用的机理主要包含分子内电荷转移(ICT)、光诱导电子转移(PET)以及荧光共振能量转移(FRET)。

分子内电荷转移是荧光探针经常运用的机理[11]。基于分子内电荷转移机制的荧光探针分子分为D-Π-A结构，其中D表示推电子基团，富含电子；A是拉电子基团，具有吸电子的能力[12]。通过两者的结合作为识别基团再通过Π键的连接得到D-Π-A结构(图1)，分子内的供给能力不同的基团即可形成电子推拉效应[13]。

图1 ICT机理荧光探针结构式

2022年，Yang课题组[14]设计并合成了一种新型荧光探针(CA-SO2)，通过亲核加成反应可高效、特异地检测SO2的衍生物，如图1所示。其设计合成的新型荧光探针 (CA-SO2) 具有高选择性、快速响应时间(50秒内)和低检测限(LOD = 75 nM)。由于该探针中存在苯并噻唑的衍生基团，且C=N之间可形成带有正电荷的铵盐，进而增强了分子内的ICT效应，使得荧光增强，发出橙色的荧光， 而在探针溶液中加入SO2衍生物后，通过发生亲核加成反应，引入了HSO3-从而导致ICT效应减弱，几乎无荧光，溶液的颜色也尤橙色变为无色，从而达到“肉眼”检测 SO2的目的。

2.1.2 光诱导电子转移

光诱导电子转移(PET)是指电子的给体或电子的受体受到光激发后，激发态的电子的给体与电子受体之间发生电子的转移进而导致荧光发生淬灭的过程。基于光诱导电子转移机制的荧光探针是由识别基因和荧光团通过连接臂连接组成[15]。基于光诱导电子转移机制的荧光探针在实际应用的过程中，通过识别基因与荧光团发生电子转移效应后，探针分子荧光淬灭，在与反应物接触后，光诱导电子转移效应受到了抑制，荧光也由此恢复。

2021年，Zhou课题组[16]开发了一种基于萘酰亚胺可用于灵敏和选择性地检测生物硫醇的荧光探针(图2)。该探针设计选择引入3,5-二硝基吡啶-2-基作为生物硫醇识别位点，由于3,5-二硝基吡啶-2-基具有很强的吸电子能力，从而使该探针发生光诱导电子转移(PET)进而使荧光猝灭，再通过引入生物硫醇从而触发亲核取代，将3,5-二硝基吡啶基团切断，从而抑制了PET的过程，进而使得荧光增强，发出黄色的荧光，以达到对生物硫醇的检测与识别。

图2 基于PET机理的荧光探针示结构式

2.1.3 荧光共振能量转移

基于荧光共振能量转移机制设计的荧光探针一般是将荧光的供体与受体通过化学键进行连接的。即在一定的条件下，供体吸收光子后，再通过长距离的偶极-偶极相互作用后，再将能量传给供体[17]。即在供体向受体进行转移的过程中，因受到外界光源的刺激后，以非辐射形式实现了能量的转移(图2)。此现象即为荧光共振能量转移(FRET)。

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2021年，Tang课题组[18]设计并合成了一种基于BODIPY荧光团的具有FRET机制的新型同型二聚体荧光探针D-TMSPB(图3)。该探针采用两个相同的具有小Stokes位移的荧光团连接而形成一个同型2聚体，并且在两个相同的荧光团之间存在FRET时，它们的荧光发生猝灭。即一个荧光团可以作为另一个荧光团的猝灭基团。而当向探针D-TMSPB溶液中加入硫醇后，可使得探针的二硫键断裂，进而产生新的二硫键，形成TMSPB，即连接体的破坏使两个荧光团扩散分开，继而导致FRET的终止和荧光强度的增强。

图3 基于FRET机理的荧光探针结构式

2.2 HClO荧光探针的研究

HClO是生物体内不可缺少的活性氧(ROS)物质之一。近年来，随着荧光探针技术的不断发展，其操作简单、灵敏度高以及特异选择性好等优势在临床检测中得到了广泛的普及和应用，并且在体内HClO的检测中取得了较好的应用成效。

2.2.1 基于对氨基酚的HClO荧光探针

2019年，Liu课题组[19]开发了一种新的探针HCA-Green(图4)。该探针使用4-溴-1,8-萘酰亚胺再结合对氨基酚，从而产生PET效应，荧光微弱。对氨基酚作为识别基团，当加入HClO后，苯酚基被切去，从而破坏了PET效应，生成发绿色荧光的MNA，使探针表现出显著的荧光强度增强，MNA作为一种理想的双光子荧光基团，具有较大的Stokes位移和光稳定性好的优点。该探针实现了对HClO的高特异性和超灵敏的荧光响应。从而提高了在单光子和双光子激发下，探针对HClO的灵敏度。

图4 探针HCA-Green检测HClO结构式

2.2.2 基于硒化物的HClO荧光探针

2020年，Jing课题组[20]设计了一种内质网靶向性的可逆荧光探针(ER-Se)(图5)。该探针是基于硒作为识别基团，当加入HClO后，实现对硒原子的氧化，使得荧光减弱，而当加入GSH后，由于GSH强的还原性，故可将其还原为原探针ER-Se从而使荧光再次恢复。该探针不仅具有可逆能力而且对HClO显示出高灵敏度和良好的选择性。此外经实验表明，该探针还具有很强的内质网靶向性的能力。

图5 探针ER-Se检测HClO机理结构式

2.2.3 基于肟化物的HClO荧光探针

2013年，Zeng课题组[21]设计并合成了一种基于BODIPY的荧光探针(bod-oxime)，如图6所示。该探针以肟基作为识别位点，引入肟基后，由于C=N异构化引起的激发态衰减过程，使探针不发荧光，而当加入HClO后，发生脱肟反应，氧化生成醛基，从而恢复了BODIPY荧光基团的绿色荧光。由于该探针结合有亲水性羧基和羟基部分故其具有高度水溶性，而且其对HClO较高的灵敏度和选择性可用与检测水介质中的HClO和活细胞成像。

图6 探针bod-oxime检测HClO机理结构式

2.2.4 基于双键氧化裂解的HClO荧光探针

2020年，Yin课题组[22]构建了一个用甲氧基取代喹啉偶联二氰基异氟酮的探针(QI)(图6、图7)。该探针采用双键作为HClO的反应位点，通过喹啉和甲醇之间的双重协同作用使双键稳定，其中二氰基和吡啶N为吸电子基团，甲氧基为供电子基团，甲氧基与吡啶N之间的“推拉”电子效应导致C=C钝化。同时相反的是，另一种C=C双键被二氰基的强电子拉力效应所激活。引入HClO后，可使得二氰基双键发生氧化裂解生成羰基，从而可以实现对HClO的特异性检测。

图7 探针QI检测HClO机理结构式

2.2.5 基于对甲氧基酚的HClO荧光探针

2014年，Yang课题组[23]报道了HKOCl-2系列的新型荧光探针(图8)。该系列探针以对甲氧基酚为识别位点，探针HKOCl-2由于PET效应而基本不发荧光，当引入HClO后，对甲氧基苯酚可氧化为对苯醌类，且正卤素取代类似物(X=F,Cl)被设计用来进一步阻断苯醌产物的氧化，从而消除PET效应，使得荧光由无色变为亮绿色。同时该探针对HClO具有良好的选择性、敏感性和化学稳定性。

图8 探针HKOCl-2检测HClO机理结构式

2.2.6 基于硫族化合物的HClO荧光探针

2021年，Zhou课题组[24]制备了一种新型的基于香豆素的荧光探针 Cou-HClO，用于基于HClO介导的氧化脱保护机制检测HClO(图9)。此探针是通过香豆素衍生物和巯基乙醇的简单缩合获得的。且该探针在没有HClO的情况下，本身表现出基于香豆素而发出强烈的绿色荧光。但与HClO反应后，此探针的荧光显着降低。且此探针表现出优异的选择性和灵敏度(检测限为16 nM)和5s内的快速响应。该探针不仅可用于对各种细胞中的外源性HClO进行成像，还可以确定炎症期间巨噬细胞中HClO的波动水平。2019年，Wang课题组[25]构建了一种基于酚噻嗪为母体的新型快速响应双光子荧光探针NS-ClO，可用于对活细胞、组织和新鲜斑马鱼中的内源性HClO进行成像。该探针NS-ClO是通过将苯并噻唑引入吩噻嗪中而开发的(图10)，其中硫原子作为HClO的识别位点。由于吩噻嗪中的硫原子对HClO具有很强的反应性，因而当加入HClO后可将吩噻嗪中的硫原子氧化为亚砜，并发射出绿色的荧光。且苯并噻唑也是一种常见的吸电子基团，在氧化和还原条件下都很稳定，故进一步确保了所构建的探针在过量的HClO中的稳定性。而且其还具有大的开启信号(约860次)和大的斯托克斯位移(约90 nm)以及对HClO的良好的选择性；因而此探针可作为检测HClO的一个工具。

图9 探针 Cou-HClO检测HClO结构式

图10 探针NS-ClO检测HClO结构式

2020年，Ma课题组[26]构建了一种用于测定HClO的新型网状靶向和比率荧光探针(图11)。该探针以4-氨基萘酰亚胺为荧光基团，以(2-氨基乙基)硫脲基团为特异性识别单元，以对甲苯磺酰胺基团为内质网定位基团。当HClO不存在时，探针通过分子内电荷转移(ICT)过程从而显示出绿色荧光。而在HClO存在下，ICT的过程受到抑制，进而导致荧光发生了蓝移变成了浅蓝色。其设计的比率荧光探针对HClO表现出高灵敏度和选择性。而且该比率型荧光探针可在很宽的pH范围内工作，荧光强度比对HClO浓度呈现良好的线性响应。此外，该探针显示出优异的内质网靶向能力，已成功应用于PC-12细胞内质网中HClO的共聚焦成像，几乎没有细胞毒性。从而可用于检测活细胞内质网中的HClO。

图11 基于硫脲识别位点检测HClO荧光探针结构式

2.2.7 基于其他识别基团的HClO荧光探针

2020年，Chang课题组[27]设计了一种基于罗丹明为母体的单分子荧光探针(ZED)(图12)。该探针可以同时检测细胞中的半胱氨酸/同型半胱氨酸、次氯酸、线粒体膜电位及线粒体通透性转变。该探针是由NBD、香豆素、咪唑盐和罗丹明四个部分连接组成，用与感知Cys/Hcy、线粒体状态和HClO。对检测Cys与Hcy因篇幅原因暂不赘述，当探针(ZED)直接加入HClO后，可将咪唑盐与罗丹明连接部分切断，进而生成发红色荧光的罗丹明B；而在探针(ZED)加入GSH后，可将NBD与香豆素之间的C-O键切断，而生成中间产物ZED-1,再次引入HClO后，又将咪唑盐与罗丹明连的接部分切断，一部分生成以香豆素荧光团为主体且发蓝色荧光的产物ZED-2，而另一部分为发红色荧光的罗丹明B，从而实现对HClO快速、有选择性、高灵敏度的识别。

图12 探针ZED检测HClO机理结构式

2020年，Wei课题组[28]成功地开发出以亚甲基蓝(MB)作为荧光团的可活化荧光探针(图13)。该探针最大的优点在于可完全溶于水，而亚甲基蓝MB也是一种很好的光声(PA)成像试剂，可用与光动力学治疗[29]。在加入HClO后可将羰基切断，生成发深蓝色光的亚甲基蓝(MB)，进而表现出显著的近红外(NIR)发射和吸收变化，同时具有较高的选择性和灵敏度，可实现对HClO特异性检测。

图13 基于MB为母体探针检测HClO结构式

2021年，Wang课题组[30]开发了一种新的基于喹啉的荧光探针(HQ)(图14)用于检测和可视化类风湿性关节炎(RA)模型中的HClO介导的炎症反应。该探针HQ具有供体-π-受体 (D-π-A) 结构，即该结构是由对羟基苯甲醛(电子供体)与1-乙基-4-甲基碘化喹啉(电子受体)通过 C=C双键连接而成，且发橙黄色荧光。当HClO存在时，带有羟基苯的探针(HQ)会被氧化为苯醌而导致吸收光谱红移，进而使得荧光发射强烈猝灭。此探针HQ具有高灵敏度和选择性、快速响应和良好的生物相容性等特点，因而可用作监测小鼠模型中HClO介导的RA治疗反应的工具。

图14 探针HQ检测HClO机理结构式

3 结 语

荧光探针用于生物体内活性氧化物的检测具有选择性高、生物相溶性好以及检测限低优点。这技术已广泛应用于在生物学和环境监测领域。近年来，各种基于新设计理念及新反应识别位点的新型HClO探针层出不穷，发展迅猛。但仍然存在一些亟需解决的关键问题，如靶向效果不够显著、靶向精准度有待提高、探针的使用过程中易受到假阳性信号干扰，在生物体内易受其他活性氧分子干扰等，开发响应灵敏度高、速率快、荧光发射波长位于近红外区域且切实能应用于深层组织或器官的HClO荧光探针是未来的发展趋势。