樟树赣柠1号茎段组织培养研究*

肖祖飞，邢梦雪，魏 希，张北红，王颜波，李 凤，金志农

(南昌工程学院，江西省樟树繁育与开发利用工程研究中心，江西南昌 330099)

香樟(Cinnamomumcamphora)隶属樟科樟属，树冠优美，枝叶茂密，深受人们喜爱，常被用于行道树、庭荫树、防护林和风景林[1]。樟木防虫耐腐，是制作家具、雕刻的良材[2，3]。香樟根、茎、叶中含有精油，可用于医药、日用化工、香精香料等[4-6]。柠檬醛是香料产业和医药工业迫切需要的原料。天然柠檬醛主要从山苍子种子中提取得到，产量低、生产成本高，远满足不了市场需求。近年来，从香樟中发现富含柠檬醛的优良单株，为天然柠檬醛的生产找到新来源，因此，优良柠檬醛型香樟种苗的繁殖是当前亟需解决的问题。目前，香樟的无性繁殖方式主要是扦插[7]和组织培养[8]。茎段组织培养能够保持母本优良性状，是香樟无性繁殖的重要方式。影响香樟组织培养的因素主要有培养基、植物生长调节剂、樟树化学型等。叶润燕等[9]研究表明，采用Murashige和Skoog (MS)基础培养基并添加不同植物生长调节剂，对香樟茎段腋芽诱导、丛生芽的增殖、生根效果较好：樟树腋芽诱导率达到90%，樟树丛生芽增殖系数高达13.1，组培苗生根率达到90%。周丽华等[10]研究表明，采用改良DCR培养基并添加合适浓度的6-苄氨基嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)，培养不同家系的香樟，有利于芽的萌发和增殖；生根培养基采用1/2 MS培养基加以合适浓度的吲哚丁酸(IBA)、吲哚乙酸(IAA)、6-BA和NAA，组培苗生根率达到96.3%。生长调节剂种类及浓度在植物组织培养过程中发挥重要作用。与激动素(KT)相比，相同浓度下6-BA对香樟不定芽的诱导效果好于KT，芽的长度和叶的数量显著高于KT[11]。香樟涌金茎段萌芽在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.02 mg/L IBA诱导培养基中萌发率达100.0%，在MS+3.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IAA培养基中腋芽能正常生长并增殖[12]。

根据枝叶精油主成分，樟树可划分为不同的化学型，樟树组织培养研究较多的是芳樟醇型、脑樟型和龙脑樟型香樟[13-15]。柠檬醛型香樟采用矮林栽培，一年采伐1次或两年采伐3次枝叶，可极大地提高柠檬醛的产量，满足市场需求。目前，以生产精油为目的的香樟矮林在江西、广西、云南等地勃然兴起，优良柠檬醛型香樟苗木需求量大、供不应求，但关于柠檬醛型香樟组织培养研究未见报道。本研究以樟树赣柠1号四年生扦插苗枝条为材料，研究外植体的采集月份、消毒时间、枝条木质化程度、生长调节剂对樟树赣柠1号茎段组织培养的影响，并对樟树赣柠1号组培生根苗的炼苗和移栽技术进行探索，为樟树赣柠1号的无性繁殖提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为樟树赣柠1号(C.camphora‘Ganning 1’，良种编号：赣S-SC-CC-004-2020)四年生扦插苗枝条，叶片鲜重出油率1.09%，柠檬醛含量56.50%。将枝条剪切成带1-2个芽的茎段(1.5-3 cm)，用自来水冲洗2 h，置于超净工作台，用质量浓度为75%的酒精(山东利尔康医疗科技股份有限公司)浸泡30 s，无菌水清洗3-5次，待用。

1.2 方法

1.2.1 枝条木质化程度对樟树赣柠1号茎段组织培养的影响

采集樟树赣柠1号四年生扦插苗一年生、二年生和三年生枝条，采用1.1节方法处理外植体，用质量浓度为0.1%的HgCl2(河北省邢台兴教化工厂)消毒6 min，之后接种在添加1.2 mg/L 6-BA和0.1 mg/L IBA的MS培养基上。每种处理接种30-35瓶，每瓶1个茎段，视为1次试验，重复3次。接种30 d后统计污染率、褐化率和萌芽率。

1.2.2 消毒时间对樟树赣柠1号茎段组织培养的影响

采集1.2.1节筛选所得到的最适枝条，采用1.1节方法处理外植体，用质量浓度为0.1%的HgCl2消毒，消毒时间分别为3 min、5 min、7 min和9 min，之后接种在添加1.2 mg/L 6-BA 和0.1 mg/L IBA的MS培养基上。每种处理接种30-35瓶，每瓶1个茎段，视为1次试验，重复3次。接种30 d后统计污染率、褐化率和萌芽率。

1.2.3 外植体的采集月份对樟树赣柠1号茎段组织培养的影响

分别在2020年5月、7月和9月采集1.2.1节筛选所得到的最适枝条，采用1.1节方法处理外植体，用质量浓度为0.1%的HgCl2消毒，消毒时间为1.2.2节筛选出的最适消毒时间，之后接种在添加1.2 mg/L 6-BA和0.1 mg/L IBA的MS培养基上。每种处理30-35瓶，每瓶1个茎段，视为1次试验，重复3次。接种30 d后统计污染率、褐化率和萌芽率。

1.2.4 生长调节剂对樟树赣柠1号茎段萌芽诱导培养的影响

于1.2.3节筛选出的最适外植体采集月份采集1.2.1节筛选所得到的最适枝条，采用1.1节方法处理外植体，用质量浓度为0.1%的HgCl2消毒，消毒时间为1.2.2节筛选所得到的最适时间，之后接种在添加6-BA (0.15 mg/L、0.3 mg/L、0.6 mg/L、1.2 mg/L)和IBA (0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.8 mg/L)的MS培养基上。每种处理接种30-35瓶，每瓶1个茎段。接种30 d后统计萌芽率。

1.2.5 生长调节剂对樟树赣柠1号组培苗增殖培养的影响

挑选1.2.4节中株高3-5 cm的无菌苗，修剪成1.5 cm长茎段，茎段至少带有一叶一芽，接种到添加6-BA (0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L)和IBA (0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L)的MS培养基上。每个处理接种20瓶，每瓶6个茎段，视为1次试验，重复3次。增殖培养30 d，统计增殖系数、株高和茎粗。

1.2.6 生长调节剂对樟树赣柠1号生根培养的影响

挑选1.2.5节中株高3-5 cm的增殖苗接种于1/2 MS培养基，培养基分别添加IBA (0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L)、NAA (0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L)。每种处理接种20瓶，每瓶7-10株，视为1次试验，重复3次。生根培养25 d，统计生根率、根数、根长和根粗。

1.2.7 樟树赣柠1号生根苗炼苗和移栽技术研究

1.2.6节中组培苗生根培养15 d，将瓶苗移至透光率25%-30%、温度25-30℃的大棚内炼苗10 d，将组培苗移出瓶外，洗净根部培养基，待移栽。以红壤土和草木灰(V∶V=5∶1)为基质，移栽前将生根苗用质量浓度为0.5%的多菌灵消毒10-15 min，之后移入装满基质的无纺布袋中央，移栽后20 d内保持空气湿度90%以上，基质保持湿润，见干即浇，每次要浇透，移栽两个月后统计移栽成活率。

1.2.8 培养条件

1.2.1节至1.2.7节所用培养基均添加30 g/L蔗糖(西陇科学股份有限公司)、7.0 g/L琼脂粉(北京索莱宝科技有限公司)，生根培养基另外再添加2 g/L活性炭(东莞市光华活性炭有限公司)，培养基pH值为5.8。培养条件为白质光、光强3 000-5 000 lx、光照时间12 h/d、温度(25±2)℃。

1.3 数据统计与方法

采用Excel 2019软件对数据进行录入、整理和方差分析。

2 结果与分析

2.1 枝条木质化程度对樟树赣柠1号茎段组织培养的影响

由表1可知，茎段的污染率和褐化率随枝条木质化程度的增加而显著升高。一年生半木质化枝的茎段的污染率和褐化率最低，分别为15.82%和10.33%，显著低于二年生木质化枝和三年生木质化枝茎段。茎段的萌芽率随枝条木质化程度的增加而显著降低：一年生半木质化枝茎段的萌芽率最高，为63.06%，显著高于二年生木质化枝茎段(10.57%)和三年生木质化枝茎段(5.62%)；二年生和三年生木质化枝茎段的萌芽率差异不显著。因此，樟树赣柠1号茎段组织培养应采集一年生半木质化枝，茎段的萌芽率高，污染率和褐化率低。

表1 茎段木质化程度对樟树赣柠1号茎段培养的影响

2.2 消毒时间对樟树赣柠1号茎段组织培养的影响

由表2可知，随消毒时间的增加，茎段的污染率逐渐降低，褐化率逐渐升高，萌芽率先增后降。与消毒3 min比较，消毒5 min、7 min和9 min的茎段污染率分别降低73.42%、74.06%、85.62%，褐化率分别提高29.76%、118.67%、469.64%。消毒5 min，茎段的污染率和褐化率分别为16.53%、10.77%，萌芽率达到最高，为55.26%。因此，樟树赣柠1号茎段用质量浓度为0.1%的HgCl2消毒5 min，诱导茎段的萌芽率最好。

表2 消毒时间对樟树赣柠1号组培苗茎段培养的影响

2.3 外植体采集月份对樟树赣柠1号茎段组织培养的影响

由表3可知，外植体的污染率和褐化率随采集月份的推后而显著升高，萌芽率则显著降低。与5月采集外植体比较，7月和9月采集外植体进行组织培养，外植体的污染率分别升高52.70%、173.14%，褐化率分别升高62.88%、135.33%，萌芽率则分别降低24.93%、66.80%。因此，5月份采集樟树赣柠1号一年生半木质化枝条进行茎段组织培养效果较好。

表3 外植体采集月份对樟树赣柠1号茎段培养的影响

2.4 生长调节剂对樟树赣柠1号茎段萌芽诱导培养的影响

由表4可知，MS+1.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培养基有利于茎段的萌芽，萌芽率为66.67%；MS+1.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA培养基所培养的茎段萌芽率次之；茎段的萌芽率最低的是MS+0.15 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培养基，萌芽率仅为16.67%。因此，樟树赣柠1号茎段萌芽诱导最适培养基为MS+1.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA。

表4 生长调节剂对樟树赣柠1号茎段萌芽诱导培养的影响

2.5 生长调节剂对樟树赣柠1号组培苗增殖培养的影响

由表5可知，IBA浓度不变时，樟树赣柠1号组培苗增殖系数随6-BA浓度的增加而增大。MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA处理组的增殖系数达到4.06，与MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA、MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA处理组差异不显著，但显著高于MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA处理组。6-BA浓度不变时，樟树赣柠1号组培苗增殖系数随IBA浓度的增加而先增加后减少，IBA浓度为0.1 mg/L时，樟树赣柠1号组培苗增殖系数最大，为3.63。IBA浓度对组培苗的株高有显著促进作用，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L IBA处理组的组培苗株高最高，为3.89 cm，高于其他处理组。各处理间组培苗的茎粗差异不显著。由此可知，樟树赣柠1号组培苗最适增殖培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA (图1)。

表5 生长调节剂对樟树赣柠1号组培苗增殖培养的影响

续表

图1 MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA诱导樟树赣柠1号组培苗增殖

2.6 樟树赣柠1号组培苗生根情况

2.6.1 生长调节剂对樟树赣柠1号组培苗生根的影响

由表6可知，不同IBA浓度处理下的组培苗生根率均达到93%以上。其中1/2 MS+2.0 mg/L IBA处理组的组培苗生根率达到100%，根数也最多，为3.60，显著高于其余3组。根长最长的是1/2 MS+1.5 mg/L IBA处理组，为9.91 cm，显著高于其他处理组。根粗随IBA浓度的增加而逐渐变小，1/2 MS+0.5 mg/L、1/2 MS+1.0 mg/L和1/2 MS+1.5 mg/L IBA处理组的根粗较大，三者之间差异不显著，但显著大于1/2 MS+2.0 mg/L IBA处理组。

表6 IBA对樟树赣柠1号组培苗生根的影响

由表7可知，1/2 MS+2.0 mg/L NAA处理组的组培苗生根率也达到100.0%，1/2 MS+0.5 mg/L、1/2 MS+1.0 mg/L和1/2 MS+1.5 mg/L NAA处理组的生根率均高达93%以上。1/2 MS+0.5 mg/L NAA处理组的根数最多，为3.02；其次是1/2 MS+1.5 mg/L和1/2 MS+2.0 mg/L NAA处理组;1/2 MS+1.0 mg/L NAA处理组的根数较少。1/2 MS+1.0 mg/L和1/2 MS+2.0 mg/L NAA处理组的根长较长，分别为7.76 cm和7.52 cm，二者差异不显著，但是显著大于1/2 MS+0.5 mg/L和1/2 MS+1.5 mg/L NAA处理组。根粗随NAA浓度的增加而逐渐增大，1/2 MS+1.0 mg/L、1/2 MS+1.5 mg/L和1/2 MS+2.0 mg/L NAA处理组的根粗较大，三者之间差异不显著，但是显著大于1/2 MS+0.5 mg/L NAA处理组。

表7 NAA对樟树赣柠1号组培苗生根的影响

综上所述，IBA和NAA浓度对樟树赣柠1号组培苗生根有显著影响。综合生根率、根数、根长和根粗指标，IBA对樟树赣柠1号组培苗的生根效果略优于NAA，樟树赣柠1号组培苗生根适宜培养基为1/2 MS+2.0 mg/L IBA。

2.6.2 樟树赣柠1号组培苗生根过程基部形态变化

樟树赣柠1号组培苗生根培养1-3 d，基部形态变化不明显；生根培养5 d时，组培苗基部切口开始愈合、膨大；生根培养7 d时，大部分组培苗基部切口愈合、膨大，表皮有凸起点；生根培养9 d时，组培苗不定根出现；培养11-14 d时，组培苗不定根继续生长，不定根明显增长、增多(图2)。

图2 1/2 MS+2.0 mg/L IBA处理诱导樟树赣柠1号组培苗生根过程

2.7 樟树赣柠1号组培生根苗的炼苗和移栽情况

生根瓶苗放入大棚炼苗10 d，之后将生根苗移栽到瓶外，在塑料薄膜小拱棚缓苗20 d，樟树赣柠1号组培生根苗移栽成活率可达90.06%(图3)。待苗木长到20-30 cm，茎木质化后可将其移入大田定植。

图3 樟树赣柠1号组培移栽苗

3 讨论

3.1 外植体的采集月份和消毒时间对樟树赣柠1号茎段组织培养的影响

外植体的采集月份不同，其生理状况和发育状态也不同，直接影响外植体的萌芽率和成活率。研究表明，5月采集南方红豆杉嫩枝进行组织培养，外植体愈伤组织诱导率最高，其次是11月，8月最差[16]。5月中旬采集毛叶木姜子当年生半木质化枝条剪取茎段，用0.2% HgCl2消毒12 min，消毒效果最佳，是毛叶木姜子无菌体系建立的最佳消毒方式[17]。本研究结果表明，5月是樟树赣柠1号茎段组织采集外植体的最适时间，这与前人研究结果基本一致，其原因可能是5月份枝条新陈代谢旺盛、生命力强，内源激素、营养物质等含量高，组织幼嫩、容易分化。消毒剂及消毒时间影响外植体的成活率，而HgCl2是植物组织培养常用消毒剂，一般使用浓度0.1%-0.2%、消毒5-10 min，外植体的成活率高、污染率和褐化率低[18,19]。本研究表明，5月采集一年生半木质化茎段，用0.1% HgCl2消毒5 min，茎段的污染率和褐化率低、萌芽率高。新长出来的枝条与外界环境接触时间短，受灰尘、细菌、真菌等污染少，容易消毒。此外，5月枝条内所含的酚类物质可能较少，降低了茎段的褐化率。

3.2 枝条木质化程度对樟树赣柠1号茎段组织培养的影响

采用扦插、组织培养等无性繁殖时，很多植物会受到成熟效应的影响。本研究表明，茎段的萌芽率随枝条木质化程度的增加而显著降低，一年生半木质化枝茎段萌芽率最高，为63.06%，显著高于二年生木质化枝茎段(10.57%)和三年生木质化枝茎段(5.62%)；污染率和褐化率随木质化程度的增加而升高。这一结果与刘均利等[20]研究毛叶木姜子组织培养试验结果基本一致，采集半木质化枝条进行茎段初代组织培养，茎段的萌芽率达到57.9%，显著高于木质化枝条(40%)和嫩枝(38.5%)。究其原因可能是二年生木质化枝和三年生木质化枝茎段枝龄大、木质化程度高、组织老，分裂能力弱，较难诱导萌芽，容易污染和褐化；一年生木质化枝的腋芽比二年生木质化枝、三年生木质化枝的腋芽饱满，营养物质丰富，二年生木质化枝和三年生木质化枝的腋芽处于休眠状态，不易诱导萌芽。因此，樟树赣柠1号茎段组织培养应该采集一年生半木质化枝，茎段的萌芽率高，污染率和褐化率低。

3.3 生长调节剂对樟树赣柠1号茎段组织培养的影响

植物生长调节剂在组培苗的生长发育过程中发挥重要作用。樟树心形胚时期的合子胚接入添加4.0 mg/L 6-BA、0.5 mg/L NAA的改良MS培养基进行初培养，再接入添加1.0 mg/L 6-BA、0.2 mg/L 2,4-D的改良MS培养基培养，胚性愈伤组织诱导率达到77.78%[21]。另外，有研究发现樟树幼胚的萌发率随6-BA浓度的增加而升高，6-BA是影响樟树幼胚早期萌发的主要影响因子[22]。本研究表明，6-BA、IBA、6-BA/IBA在樟树赣柠1号茎段的萌芽、组培苗的增殖和生根过程中起重要作用。在IBA浓度不变的情况下，茎段的萌芽率随6-BA浓度的增加而升高；在6-BA浓度不变的情况下，茎段的萌芽率随IBA浓度的增加而降低。此外，茎段的萌芽率随6-BA/IBA比值的升高而升高。6-BA/IBA为1.5时，茎段的萌芽率最低；6-BA/IBA为12时，茎段的萌芽率达到最高，为66.67%。6-BA、IBA、6-BA/IBA对樟树赣柠1号组培苗的增殖也有显著影响。IBA浓度不变时，增殖系数随6-BA浓度、6-BA/IBA比值升高而增大，6-BA浓度为2.0 mg/L、6-BA/IBA为20时，增殖系数最大，为4.06。IBA和NAA对樟树赣柠1号组培苗的生根有显著促进作用，且IBA对组培苗的生根效果优于NAA，1/2 MS+2.0 mg/L IBA处理组生根率达到100%。辜夕容等[23]研究表明，高浓度的6-BA有利于香樟茎段上隐芽的萌动与生长，而低浓度的6-BA有利于愈伤组织的生长；6-BA/NAA的比值对香樟茎段隐芽的萌动与生长、愈伤组织的生长有较大影响，6-BA/NAA为40时，茎段的萌芽生长最好，6-BA/NAA为5时有利于愈伤组织的形成。

3.4 樟树赣柠1号组培生根苗炼苗和移栽研究

组培苗移栽成活率的高低决定组培技术成功与否。瓶内组培苗比较脆弱，需在有条件设施的地方炼苗一段时间才能移栽、造林[24]。有研究表明，黄樟组培苗在常规环境中炼苗3-5 d，可进行移栽。移栽前用百菌清可湿性粉剂800-1 000倍液浸沾后沥干，以泥炭土和珍珠岩混合基质为栽培基质，移栽后适当遮光、覆膜，可使黄樟组培苗成活率和新叶率达85%以上[25]。本研究表明，樟树赣柠1号组培生根苗在透光率25%-30%、温度25-30℃的大棚内炼苗7-10 d，可移出瓶外，适当遮光、用塑料薄膜拱棚保持空气湿度90%以上，移栽成活率可达90%以上。

4 结论

樟树赣柠1号适宜在5月份采集一年生半木质化枝条进行茎段组织培养，茎段用质量浓度0.1%的HgCl2消毒，消毒最适时间为5 min。6-BA和IBA在茎段萌芽、增殖和生根培养过程中起重要作用。茎段萌芽最适培养基为MS+1.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA，萌芽率达到66.67%；最适增殖培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA，增殖系数为4.06；生根适宜培养基为1/2 MS+2.0 mg/L IBA，生根率达到100%。