β-木糖苷酶的研究进展*

梁 蒙，林 宇，黄日波，杜丽琴

(广西大学生命科学与技术学院，广西南宁 530005)

β-木糖苷酶是木聚糖降解的关键酶之一，在半纤维素底物的转化过程中具有十分重要的作用，可以广泛应用于食品、饲料、造纸和能源等行业。β-木糖苷酶对4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(4-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside，pNPX)具有高度的底物特异性。此外，研究发现有少数β-木糖苷酶对4-硝基苯基-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(4-nitrophenyl-α-L-arabinopyranoside，pNPA)或4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG)也具有一定的水解活力[1]。这些双功能或者多功能的β-木糖苷酶，在底物识别以及木质纤维素资源转化方面都具有十分重要的应用潜力。β-木糖苷酶来源十分广泛，当前以细菌和真菌类来源的β-木糖苷酶报道最多。近年来，研究人员通过基因工程手段克隆和表达许多不同微生物来源的β-木糖苷酶基因，并从中发现一些具有转糖苷功能或者水解功能的β-木糖苷酶。

β-木糖苷酶的转糖苷功能是通过将供体如pNPX或者木二糖的木糖基转移到单糖、木寡糖和一些短链醇类的受体上，形成长链木寡糖和烷基木糖等含有木糖基的糖苷类化合物，这些糖基化的糖苷类化合物具有益生元、抗微生物、表面活性剂等作用，在食品、医疗和化妆品领域具有潜在的应用价值。而β-木糖苷酶的水解功能比较丰富，一方面，它可以和内切木聚糖酶协同水解木聚糖，内切木聚糖酶随机作用于木聚糖内部的糖苷键，产生短链木寡糖，而β-木糖苷酶随后作用于这些短链木寡糖并产生大量的木糖，木糖被工业化酵母利用后可以产生具有高附加值的木糖醇和乙醇；另一方面，β-木糖苷酶还可以水解含有木糖基的化合物，如7-木糖-10-去乙酰紫杉醇、人参皂苷和三七皂苷等，产生在治疗癌症方面具有重要作用的生物活性物质。基于其功能的多样性，β-木糖苷酶在农业、工业、医药和环保方面已得到广泛应用，但总体还没有达到大规模应用的程度，主要原因在于酶自身性质的不足，如不稳定性、活力低和耐受性差等。因此，可通过分子改造技术定向地改造β-木糖苷酶，提升其性能，从而满足各行各业的需求。当前，越来越多家族的β-木糖苷酶晶体结构陆续得到解析，这对于加深人们对β-木糖苷酶结构方面的了解和后续的分子改造研究都具有十分重要的意义。

1 β-木糖苷酶的分类

迄今为止，碳水化合物活性酶(CAZy)数据库已经划分172个糖基水解酶(Glycoside Hydrolases，GH)家族，基于保守型氨基酸序列的相似性，将β-木糖苷酶划分为GH1、GH2、GH3、GH11、GH30、GH39、GH43、GH51、GH52、GH54、GH116和GH120家族，其中各家族的信息如表1所示。目前大部分报道的细菌和真菌来源的β-木糖苷酶主要集中在GH3、GH39、GH43和GH52家族，其中，细菌来源的β-木糖苷酶主要集中在GH39、GH43和GH52家族，而真菌来源的β-木糖苷酶主要集中在GH3和GH43家族[2-4]，丝状真菌来源的β-木糖苷酶主要集中在GH3家族。

表1 β-木糖苷酶家族在CAZy数据库中的分类

续表

2 β-木糖苷酶的性质

β-木糖苷酶来源广泛且性质各异，β-木糖苷酶的最适pH值为5.0-7.0，真菌类β-木糖苷酶的最适pH偏弱酸性(表2)。β-木糖苷酶的最适反应温度一般在40-60℃，嗜热且热稳定性良好的β-木糖苷酶也引起研究者们的关注。Rizzatti等[5]从Aspergillusphoenicis的发酵液中分离到一种具有热稳定性的β-木糖苷酶，该酶的最适反应温度为75℃。此外，Shi等[6]从嗜热菌Thermotogathermarum中分离到一种β-木糖苷酶，该酶的最适反应温度为95℃，并且在85℃以下都具有较好的热稳定性。β-木糖苷酶的热稳定性在酶的储存和工业化处理方面具有明显的优势。底物特异性方面，β-木糖苷酶对pNPX具有高度的底物特异性，同时对pNPA也具有一定的催化活性。木糖耐受性是影响β-木糖苷酶商业化应用的一个重要因素，GH3家族中β-木糖苷酶的木糖耐受性偏低，其Ki值为2-20 mmol/L，而GH39和GH43家族中的β-木糖苷酶具有较高的木糖耐受性，其Ki值为40-200 mmol/L，这些高耐受性木糖的β-木糖苷酶可以更好地水解木寡糖，有利于β-木糖苷酶和木聚糖酶发挥出更好的协同作用。

表2 不同来源的β-木糖苷酶的性质

3 β-木糖苷酶的蛋白结构

目前，β-木糖苷酶的酶学性质已得到大量表征,但是关于β-木糖苷酶结构方面的研究仍比较欠缺，只有来源于GH39、GH43、GH52和GH120家族的β-木糖苷酶的晶体结构得到解析，其结构如图1所示，对应蛋白质数据库(Protein Data Bank，PDB)中的编号分别为4EKJ、5Z5H、4C1P和3VSV，不同GH家族的β-木糖苷酶在结构上存在一定的差异性。

图1 不同家族来源的β-木糖苷酶的蛋白质晶体结构

GH39家族被归类为GH-A宗族，该宗族中的酶都有一个(β/α)8桶装结构域，并且由两个保守的羧酸残基分别作为亲核试剂和质子供体。由于这两个残基分别位于第4个和第7个β-折叠上，因此也被称作“4/7超家族”[19]。来源于GH39家族的β-木糖苷酶蛋白质的四级结构具有多样性，含有单聚体、三聚体、四聚体和八聚体等多种类型的聚合体。GH43属于GH-F宗族，该家族中β-木糖苷酶都有一个由5片桨叶组成的β-螺旋桨核心结构域[20]。此外，在该家族已经报道的β-木糖苷酶中，还具有一个α/β三明治结构域[21]，两个结构域在底物催化上共同发挥作用。GH43家族中的β-木糖苷酶的四级结构种类丰富，主要包含单聚体、二聚体和四聚体3种类型。与GH39和GH43家族相比，关于GH52和GH120家族的β-木糖苷酶的晶体结构报道相对较少。GH52家族中β-木糖苷酶的第一种晶体结构(PDB：4C1P)在2014年被Espina等[22]所报道，它的三级结构是由N端折叠形成的β-三明治结构域和C端的(α/α)6桶状结构域所组成，其四级结构是一种单聚体。此外，GH52家族中还有一种来源于Bacillussp.的β-木糖苷酶的结构被报道[23]。而GH120家族中仅有来源于ThermoanaerobacteriumsaccharolyticumJW/SL-YS485的β-木糖苷酶的晶体结构(PDB：3VSV)被报道[24]。

4 β-木糖苷酶的催化机制

随着对β-木糖苷酶的深入研究，其催化作用机制也相对明确。β-木糖苷酶催化反应的实质是亲核试剂和质子供体参与的酸碱催化反应。迄今为止，β-木糖苷酶的作用机制分为保留型和反转型两种类型。反转型的β-木糖苷酶通过一步单取代机制使产物的异头碳构象完全反转，由原来的β型转变为α型。而保留型的β-木糖苷酶通过糖基化和去糖基化两步双取代机制参与催化，产物的异头碳构象不发生变化。目前已发现的β-木糖苷酶，只有GH43家族的β-木糖苷酶属于反转型机制，而分布相对集中的GH3、GH39、GH52家族的β-木糖苷酶均属于保留型。研究人员发现，保留型的β-木糖苷酶可以催化水解和转糖苷两种反应的进行，而反转型的β-木糖苷酶在催化水解反应上更具有优势[25]。β-木糖苷酶催化的水解反应和转糖苷反应，其区别在于去糖基化过程中进入活性中心的是水分子还是底物分子，如果进入活性中心的是水分子则发生的是水解反应，反之则是转糖苷反应。因此，水解反应和转糖苷反应是两个可逆的过程[26]。

5 β-木糖苷酶的功能研究

5.1 β-木糖苷酶转糖苷功能的研究

β-木糖苷酶可以催化糖苷键的合成，在供体和受体的参与下，可以产生在食品、医药、化工等领域具有应用潜力的糖苷化合物。木二糖、木寡糖和pNPX是最常见的供体，而受体主要为糖类和醇类化合物，供体和受体的变化都会对转糖苷反应产生显著的影响。

目前，关于β-木糖苷酶转糖苷反应的报道中，常见的糖类受体主要是一些单糖(如木糖、葡萄糖、甘露糖和阿拉伯糖等)和木寡糖(木二糖和木三糖)。二糖类受体(蔗糖和麦芽糖)的报道较少且转糖苷效率普遍低下。Kurakake等[27]发现β-木糖苷酶Xaw1以木二糖作为供体和受体，经过转糖苷反应后能产生木三糖、木四糖和木五糖，且受体浓度对水解效率和转糖苷效率具有显著的影响，当受体浓度较低时水解效率较高，随着受体浓度的增加，水解效率下降而转糖苷效率逐渐升高。此外，在β-木糖苷酶的转糖苷反应中，醇类也是常见的受体，通过将pNPX或者木二糖中的木糖残基转移到醇类受体上，可以生成一些烷基糖苷类化合物，这些糖基化的糖苷化合物具有良好的抗微生物和表面活性剂作用[28]。醇类碳链的长度会影响β-木糖苷酶对醇类的转糖苷效率，随着醇类碳链长度的增加，转糖苷的效率会呈明显下降的趋势，这可能与小分子醇类更容易进入酶的活性中心有关。Muzard等[29]发现，β-木糖苷酶XylBH39以木三糖和木寡糖稀释液为供体，以不同长度碳链(C1-C8)的醇类为受体的转糖苷反应中，碳链长度在C1-C5内的醇类适合为受体，而碳链长度超过C5的醇类不适合为受体，并且还推断对短链醇的偏好性可能与酶活性中心存在疏水性氨基酸有关。β-木糖苷酶的转糖苷反应中，除糖类和醇类外，部分酚类化合物[30]和烷基糖苷类化合物[31,32]也可作为受体。此外，Boer等[33]发现，β-木糖苷酶rhGBA以4-甲基伞形酮-β-D-木糖苷为供体，分别以荧光和中性的胆固醇为受体，都有转糖苷产物的产生。

5.2 β-木糖苷酶水解功能的研究

除催化糖苷键的合成外，β-木糖苷酶还可以催化糖苷键的水解。自然界中许多化合物都含有β-木糖苷键，利用β-木糖苷酶的水解功能对糖苷化合物进行转化，可以获得具有更高生物活性或高附加值的物质。目前，已报道的含有β-木糖苷键的化合物主要有木聚糖、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇、部分人参皂苷和三七皂苷等。

木聚糖主要分为硬木木聚糖和软木木聚糖，其骨架是由多个木糖基通过β-1,4糖苷键相连而成，侧链含有乙酰基、阿拉伯糖基、葡萄糖醛酸等多个取代基团[34,35]。由于结构复杂，其完全被水解需要包括木聚糖酶和β-木糖苷酶在内的多种木聚糖水解酶的参与。其中，木聚糖酶随机作用于木聚糖内部的糖苷键，产生短链的木寡糖，而β-木糖苷酶随后作用于这些木寡糖的非还原性末端释放出大量的木糖。β-木糖苷酶对木寡糖的水解减弱了木寡糖本身对木聚糖酶的反馈抑制作用，有利于木聚糖酶对木聚糖的彻底水解。目前对木聚糖水解的研究主要分为两个方面，一方面是通过木聚糖酶的单独水解作用，从而获得一些具有益生元作用的木寡糖[36-39]；另一方面是通过木聚糖酶、β-木糖苷酶以及阿拉伯呋喃糖苷酶等多种木聚糖水解酶的协同水解作用，产生木糖和阿拉伯糖[40-43]。此外，随着研究的深入，目前也有较多关于β-木糖苷酶可以单独水解木聚糖的报道[44-46]，并且水解木聚糖的类型也比较丰富。Herrmann等[47]发现一个来源于TrichodermareeseiRUT C-30的β-木糖苷酶，该酶除了可以水解聚合度为2-7的木寡糖外，还可以水解山毛榉木聚糖和4-O-甲基-葡糖醛酸木聚糖。Michelin等[48]从Aspergillusochraceus中得到一个胞外的β-木糖苷酶，该酶可以单独水解桦木木聚糖、落叶松木聚糖、燕麦木聚糖和桉树木聚糖。Zanphorlin等[49]发现，将一个假定的β-木糖苷酶的247位氨基酸Lys突变为Ser后，该酶同时具有β-木糖苷酶和木聚糖酶的活性。但这些报道的β-木糖苷酶水解木聚糖的活力比较微弱，而且尚未有结构相关的文献来解释其机理，有待学者们进一步研究。

β-木糖苷酶在水解7-木糖-10-去乙酰紫杉醇方面作用显著，通过移除其C7位的木糖基团可以生成具有高药用价值的紫杉醇的药物中间体10-去乙酰紫杉醇，后者可以进一步酰化得到紫杉醇。紫杉醇主要从天然红豆杉中提取，但在红豆杉中的含量极低，而其衍生物7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的含量却是紫杉醇的50倍左右。因此，β-木糖苷酶对于7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的水解作用在生物酶法合成紫杉醇的过程中占有十分重要的地位。目前已有多篇关于β-木糖苷酶水解底物7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的报道，当底物浓度在1 g/L时，中间产物10-去乙酰紫杉醇的转化率为92%-98%[50-52]。Cheng等[53]发现，β-木糖苷酶LXYL-P1-2在7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的底物浓度为0.625 g/L时转化率能达到100%，当底物浓度提高到10 g/L时，转化率也能达到85.6%。

β-木糖苷酶在水解人参皂苷方面也具有十分重要的作用，通过移除人参皂苷中含有的木糖基团，可以将其转化成具有药用价值的稀有人参皂苷。目前已报道的含有木糖基团的人参皂苷主要包括两种类型，一种是原人参二醇(PPD)类型的人参皂苷Ra1、Ra2、Ra3、Rb3，另一种是原人参三醇(PPT)类型的三七皂苷R1和R2。Shin等[54]发现，来源于BifidobacteriumbreveK-110的β-木糖苷酶可以水解人参皂苷Ra1和Ra2含有的木糖基团，将其分别转化为人参皂苷Rb2和Rc。而Zhang等[55]利用来源于ThermotogapetrophilaDSM 13995的β-木糖苷酶Tpexyl3和一个热稳定的β-葡萄糖苷酶Tpebgl3将人参皂苷Rb2和Rc转化为人参皂苷20(S)-Rg3，这种稀有皂苷对肺癌、结肠癌、卵巢癌等多种癌症的癌细胞具有抑制和抗转移作用。此外，三七皂苷R1和R2分别含有一个木糖基，以β-1,2-糖苷键与葡萄糖基相连，通过β-木糖苷酶的水解作用可以将其分别转化为人参皂苷Rg1和Rh1，这两种皂苷都具有抗炎、抗氧化和预防癌症的作用[56,57]。目前已有超过180种人参皂苷被鉴定出来，不同种类的人参皂苷含有糖苷键的种类、数量和位置都有所不同，常见的糖苷键主要由β-木糖苷键、β-葡萄糖苷键、α-阿拉伯呋喃糖苷键等组成，因此β-木糖苷酶对人参皂苷的水解，也需要包括β-葡萄糖苷酶和α-阿拉伯呋喃糖苷酶等在内的多种酶的参与和协同。

6 β-木糖苷酶的分子改造

β-木糖苷酶在自然界中的存在十分广泛，常见于细菌和真菌类微生物。目前报道的多数细菌和真菌类的β-木糖苷酶都来源于温和的环境，不能满足农业和工业催化过程中所需要的多种条件。酶的分子改造主要是通过定向进化、理性设计和半理性设计的手段来实现，改造后的酶分子性能通常得到极大的改善。因此，通过对其定向地进行分子改造，从而获得在酶活力、木糖耐受性和稳定性方面更具优势且满足工艺需求的β-木糖苷酶已成为一种常规的手段。

酶活力是β-木糖苷酶理化性质中的一个重要参数，与底物的催化效率密切相关。酶活力的提高可以极大地减少酶量的使用和反应所需的时间，这对于节约工业生产中所需要的成本具有十分重要的意义。因此，通过分子改造对β-木糖苷酶进行突变，从而提高其酶活力是当前研究的热点之一。李琦等[58]从嗜热菌Dictyoglomusthermophilum中克隆并异源表达了β-木糖苷酶Xln-DT，通过定点突变在202位氨基酸处引入苯丙氨酸PHE和亮氨酸LEU，获得突变体Xln-DT-202PHE和突变体Xln-DT-202LEU，其酶活力比原来分别提高3.28倍和2.97倍。Hartanti等[59]将来源于GeobacillusthermoleovoransIT-08的β-木糖苷酶GbtXyl43A的121位Asp分别突变成Val、Asn和Glu，结果发现Asp121突变为Val121和Asn121后，这两个突变体的最适pH值比原来提高3.0个单位，并且在40℃时，所有突变体的酶活力都得到极大的提高。

热稳定性是β-木糖苷酶理化性质中的另一个重要参数，对于酶的贮存和工业化的应用都具有十分重要的意义。传统筛选方法得到的β-木糖苷酶热稳定性相对较差，不能满足工艺生产的需求。近年来，研究人员发现对β-木糖苷酶中某些重要的氨基酸进行突变改造后，其原有的热稳定性得到极大的改善。Dehnavi等[60]对β-木糖苷酶SXA进行定点突变获得两个突变体C101V和C286V，结果发现这两个突变体在55℃和60℃时的热稳定性显著增加。Singh等[61]利用DNA改组技术对β-木糖苷酶XylBH43进行突变，得到热稳定性明显改善的突变体R45K、M69P、L186Y和L186K，尤其以突变体L186K的热稳定性改善最明显，其Kt0.5值增加8.1。

此外，对β-木糖苷酶进行分子改造在揭示水解及转糖苷过程中参与催化的关键氨基酸方面具有十分重要的作用。Huang等[62]将来源于Geobacillusstearothermophilus的β-木糖苷酶GSxyn的509位酪氨酸突变为谷氨酸后，β-木糖苷酶GSxyn同时具有β-木糖苷酶和外切木聚糖酶的活性。Ochs等[63]对β-木糖苷酶BhXyl39参与以pNPX为供体、辛醇为受体的转糖苷反应中的关键氨基酸进行研究，通过定点突变将F166、F167和Y284分别突变为(A166和S166)(A167和S167)(A284和S284)，结果发现Y284在识别和结合pNPX的过程中具有重要的作用，F166突变为A166后减小了辛醇进入受体结合位点中的空间位阻，进而促进了突变体A166对辛醇转糖苷反应的进行。

酶分子在生物进化过程中远未达到完美的程度，通过分子改造技术，使β-木糖苷酶原有的性能得到显著的改善，获得大量具有优异性能的β-木糖苷酶，极大地丰富了农业和工业化用酶的选择。

7 展望

近年来，随着对木聚糖水解酶系的深入研究，关于β-木糖苷酶的筛选及其转化半纤维素类木聚糖的研究也取得较大的进展。当前，对于β-木糖苷酶的研究主要集中在β-木糖苷酶的筛选、分子克隆与表达、酶学性质表征以及协同木聚糖酶转化利用半纤维类木聚糖等方面。酶活力、热稳定性和木糖耐受性是影响β-木糖苷酶工业化应用的重要因素，而目前报道的细菌和真菌来源的β-木糖苷酶在这些方面各有优劣，极大地限制了β-木糖苷酶的进一步开发和利用。此外，当前并没有高通量筛选β-木糖苷酶的有效方法，因此筛选一些酶活力高、木糖耐受性和热稳定性好的β-木糖苷酶仍是一个长期且艰巨的任务。

β-木糖苷酶是木聚糖水解的关键酶之一，对于木聚糖水解，当前的研究主要集中在β-木糖苷酶和木聚糖酶两者协同作用的方面，而关于它们和α-阿拉伯呋喃糖苷酶以及阿魏酸酯酶之间协同作用的研究还很欠缺。目前已发现一些具有α-阿拉伯呋喃糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活力的双功能或者多功能的β-木糖苷酶，打破了β-木糖苷酶对底物高度特异性的传统认知，但其作用机制还有待进一步研究。此外，β-木糖苷酶在生物活性物质转化方面的研究也很欠缺，当前报道的可以被β-木糖苷酶转化成具有生物活性物质的底物相对较少，主要包括7-木糖-10-去乙酰紫杉醇、部分人参皂苷和三七皂苷类化合物，后续可以利用一些化学数据库如ZINC (https://zinc.docking.org/)和PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)去筛选含有木糖基的化合物，进而将其转化成具有生物活性或者高附加值的物质。

目前已有较多关于β-木糖苷酶理化性质和功能性研究方面的报道，但是关于其蛋白质结构方面的研究仍较少，只有部分GH39、GH43、GH52和GH120家族的β-木糖苷酶蛋白质晶体结构得到解析，而对于β-木糖苷酶分布比较集中的GH3家族，目前还没有关于该家族蛋白质结构方面的报道。因此，后续可以加大对β-木糖苷酶蛋白质结构方面的研究，通过基因工程和蛋白质工程技术对β-木糖苷酶蛋白质结构进行定向改造，进而获得一些具有优良性能或者工业应用潜力的β-木糖苷酶。