活性氧影响精子超微结构的研究进展

张喜艳，阎一鑫，秦红平，宋 诚(综述)，王 玲(审校)

成熟的精子是高度分化的单细胞，其包括头部和尾部区域。精子的头部有一个高度浓缩的细胞核，核的前三分之二部有顶体覆盖。尾部是精子的运动装置，尾部的中段包有一圈线粒体鞘，线粒体为鞭毛摆动提供能量。在《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》[1]关于精液质量的分析评价标准中，将精子分类为前向运动、非前向运动和不活动精子。前向运动精子百分率+非前向运动精子百分率≥1.5×107/ml，精液体积≥1.5 ml。精子正常形态和质量参数是临床精液分析的关键指标。活性氧(reactive oxygen species，ROS)代表广泛的分子类别，包括自由基、非自由基和氧衍生物等。ROS损害精子形态结构包括脂质过氧化、脱氧核糖核酸(DNA)损伤增加、线粒体损伤而导致精子运动性降低、精子相关参数异常、卵母细胞与精子融合减少。形态异常精子超微结构的发生机制为男性不育的临床治疗提供可能的理论依据。本文就精子形态异常的发生机制作一综述。

1 ROS对精子核DNA的影响

ROS引起的精子核DNA损伤机制包括DNA片段化[2]、DNA突变[3]、DNA碱基的氧化[4]和DNA损伤精子过早进入凋亡途径[5]。研究显示，在不同发育阶段精子亚群中ROS产生水平有显著差异，发现ROS的产生在一部分未成熟精子中最高，而在一部分成熟精子中最低，所以在精子形成过程中从生精小管到附睾未成熟精子产生的内源性ROS对成熟精子的氧化损伤可能是ROS对精子核DNA损伤的重要机制之一[6]。有研究在精子的终末分化过程中，核组蛋白被鱼精蛋白所取代，鱼精蛋白具有许多半胱氨酸残基，在附睾运输过程中被氧化，建立了一系列分子间和分子内二硫键，用于稳定核染色质结构[7]。这种稳定性使DNA更能抵抗氧化应激，然而精子的保护机制也是其损伤机制的基础。研究者使用荧光探针(色霉素与精蛋白竞争精子DNA小沟中的结合位点)检测，结果显示精蛋白化过程受损越严重，观察到的标记越多，提出男性生殖系中的染色质保护和对DNA损伤的易感性，即在精子形成受损的情况下观察到的有缺陷的染色质重塑，通过创造一种易受攻击的状态，构成了精子DNA损伤病因学的又一个原因。DNA片段化可以通过脂质过氧化的副产物被ROS间接诱导，特别是丙二醛和4-羟基壬烯醛，它们可以引入DNA加合物，导致DNA损伤[8-9]。直接氧化损伤DNA碱基导致形成加合物如8-羟基-20-脱氧鸟苷，特别是在具有功能欠佳的鱼精蛋白保护下[10]。自由基可以引发生殖细胞的凋亡，导致Caspase介导的DNA酶促降解[11]。细胞凋亡可确保没有缺陷的生殖细胞分化为精子，开始凋亡但未完成凋亡过程的生殖细胞将产生受损的精子。过量的ROS会诱导DNA损伤[12]，并激活精子的凋亡途径[13]。由上述可知，精子核DNA易受ROS攻击，临床研究显示反复性流产患者的配偶DNA碎片化水平明显升高[14]。一些研究还表明，特发性男性不育症患者的精子DNA碎片明显多于正常的可育对照男性[15]。氧化应激介导的DNA损伤在早产、先天性畸形、儿童癌症、不孕症和辅助生殖技术中具有重要指导意义。

2 ROS对精子顶体的影响

顶体是位于精子核区域的膜结合细胞器，类似于覆盖细胞核前部的帽子[16]。顶体反应涉及顶体内容物的胞吐作用以及精子质膜与顶体外膜的融合[17]。在顶体反应中，丙烯醛从顶体囊泡中释放出来，水解并穿透卵母细胞周围的外膜。丙烯醛的活性在此过程中起着至关重要的作用[18-19]，有研究报道氧化应激与丙烯醛活性受损有关[20]。精子为了获得受精能力，首先需要在雌性生殖道中获能。获能的精子具有结合卵母细胞透明带并经历顶体反应的能力，顶体反应可以使精子渗透并与卵母细胞受精，并被认为是受精的决定因素，大量的ROS产生导致精子顶体膜的过氧化和顶体活性降低，导致精子-卵母细胞融合受损。由氧化应激所致顶体反应受损是男性不育因素之一。

3 ROS对精子线粒体的影响

线粒体DNA容易受到氧化损伤及突变[21]。ROS是线粒体氧化磷酸化系统的副产物，这一反应可能是ROS损害线粒体DNA基础。由于线粒体DNA的空间接近线粒体电子传输链介导的线粒体ROS生成位点，缺乏保护性组蛋白及其有限的DNA修复机制，线粒体DNA更容易受到氧化损伤。此外，线粒体DNA的细胞改变可能会损害线粒体氧化磷酸化并促进ROS的产生，从而加快DNA突变的速度。所以，线粒体DNA是ROS诱导和攻击的第一个位点[22]。线粒体影响精子发生过程，线粒体基因组缺陷和相关呼吸链功能障碍可能会破坏线粒体的正常分化导致精子发生缺陷[19]。继发ROS的产生导致线粒体生理功能的下降[23-24]。继而功能失调的线粒体中ROS的产生显著增加形成自我破坏循环。线粒体膜电位是通过在线粒体复合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅰ、Ⅳ耦合电子转移过程中通过质子梯度产生的，是促进复合物V构象变化的关键点，从而导致了腺嘌呤核苷三磷酸的产生[25]。实验显示，主要的线粒体膜蛋白的表达降低与线粒体膜去极化和ROS的产生增加有关，线粒体产生ROS水平升高与主要的线粒体膜蛋白表达降低有关，并且可能通过降低线粒体膜电位水平和脂质过氧化作用调节精子活力[26]。线粒体内膜中打开钙依赖性孔，钙超载引起的线粒体通透性转变尤其会导致体细胞中ROS产生增加和线粒体膜电位耗散，ROS产生增加与DNA片段化有关[27]。由于脂质过氧化作用而产生的亲电子醛(例如4-羟基壬烯醛和丙烯醛)靶向人类精子的线粒体，并以剂量和时间依赖性方式刺激线粒体超氧化物的产生。研究表明4-羟基壬烯醛激活线粒体电子泄漏涉及琥珀酸脱氢酶活性的破坏和固有凋亡级联的后续活化，首先是线粒体膜电位的丧失并终止于氧化DNA加合物的形成，DNA链断裂和细胞死亡[28]。父体的线粒体DNA通常不会传递给胚胎，父体线粒体DNA在合子内降解，配子进入卵母细胞，所以精子线粒体损伤会导致弱精症和男性不育。

4 ROS对精子轴突的影响

有实验使用过氧化氢或黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶组合治疗Percoll分离的精子时，精子鞭毛搏动频率会逐渐下降，直到完全停滞，从而证实精子轴突受到ROS的影响，并且存在有限的内源性修复机制来逆转这些损伤[29]。精子活动力受到损伤可影响精子质量而导致男性不育。

5 ROS对精子质膜的影响

脂质膜由大量的多不饱和脂肪酸组成[30]，二十二碳六烯酸是人类精子质膜中主要的多不饱和脂肪酸。自由基可将其双键氧化形成的共轭二烯自由基，迅速与氧气反应形成脂质过氧自由基，该自由基从其他脂质分子中提取氢原子形成脂质氢过氧化物。金属(铁盐和铜盐)或其络合物会导致脂质氢过氧化物生成烷氧基和过氧基自由基，然后这些自由基会继续在膜内进行链式反应并在整个细胞内传播损伤，脂质过氧化物分解的副产物之一是丙二醛。ROS诱导的精子膜过氧化会降低其流动性，从而降低其尾部运动，降低精子运动能力及与卵母细胞融合的能力，导致较少的精子到达卵子进行受精。

6 结语

ROS目前被认为是男性不育的主要原因之一。精子的生理功能需要低水平的ROS，其水平的升高会干扰精子的功能，从而导致脂质过氧化、核DNA损伤和线粒体损伤等，导致男性不育。因此，早期诊断不育症是有必要的，以防止患者因长期氧化应激造成不可逆转的损失。精子形态学和精子超微结构的损伤机制，从病因学的角度解释男性不育症，为临床治疗提供了参考价值。