鼠李糖乳杆菌GG在心血管疾病中的研究进展

韦金涛，李泽桦(综述)，区彩文(审校)

心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)包括冠心病、高血压和心力衰竭等，是全球非传染性疾病死亡的首要原因[1]。CVD发病率和病死率均居我国前列，且随着吸烟、不健康饮食等危险因素的增多，CVD患者的人数还在持续增加且发病年龄趋向年轻化[2]。近年来，研究表明肠道菌群失调及其代谢产物水平的变化是促进包括CVD在内的多个系统疾病发生发展的重要因素。从肠道菌群角度寻找CVD治疗的策略是目前的研究热点。益生菌是一类能够为机体带来多种益处的活体微生物，具有抗炎、抗氧化应激、调节肠道菌群和保护肠道屏障等多重功能。随着心-肠轴、脑-肠轴、肺-肠轴等概念的提出，益生菌被广泛应用于心血管系统、神经系统和呼吸系统等的研究。鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus Gorbach-Goldin,LGG)是目前研究较为广泛且具有临床应用潜力的益生菌之一，其较强的抗炎、抗氧化应激、调节菌群代谢和保护肠屏障等功能展现出了巨大的心血管保护潜力。本文就LGG在CVD中的研究进展作一综述。

1 LGG的概述及优点

益生菌筛选的经典标准主要包括抵御胃肠道极端环境、稳定的胃肠道黏附特性、抑制病原菌、对机体产生多种益处等[3-4]。其性能评价的关键在于能否抵御人体胃肠道极端环境并成功定植。LGG是由Gorbach和Goldin于1985年从1名健康志愿者的粪便样本中分离出的1株革兰阳性乳杆菌[4]。近40年来的研究表明LGG具有出色的耐受胃肠道极端环境以及稳定的胃肠道定植能力，且对沙门氏菌、大肠杆菌等多种病原菌的生长均有一定的抑制作用。这为LGG发挥其保护功能奠定了基础。

1.1耐受胃肠道极端环境 耐受胃肠道强酸强碱环境并存活是筛选潜在益生菌的首要标准，也是益生菌能否进入机体起效的先决条件。LGG能耐受胃内强酸性环境以及小肠内胆汁的强碱性环境，在经过上消化道进入结肠的过程中存活并定植于胃肠道[4]。有研究显示，在酸性条件下LGG依然能够产生92种效应蛋白，且酸性环境能够刺激LGG的菌毛特异性黏附基因SpaC和SpaF表达，提高LGG的黏蛋白结合能力从而促进LGG在肠道定植[5-6]。

1.2在胃肠道中定植 良好的胃肠道定植能力是益生菌与机体产生相互作用的前提。只有黏附于机体胃肠道，益生菌才能发挥调节机体免疫、稳定肠道屏障和调节代谢等一系列功能。LGG是目前已知的唯一拥有黏液结合菌毛结构的益生菌，具有Spa-CBA和Spa-DEF两种菌毛编码基因簇[7]。目前在LGG中仅观察到Spa-CBA菌毛结构，研究发现SpaC菌毛亚基是介导LGG黏附于人体肠道的关键角色[8]。另有研究发现LGG强大的胃肠道黏附能力还得益于其自身结构如胞外多糖(extracellular polysaccharide,EPS)、黏附蛋白LGG-0186和表层蛋白等，多个结构相互协作共同促进了LGG在人体胃肠道内的定植。体内研究表明，口服LGG 7 d后粪便样本中仍能检测出LGG[9]，结肠黏膜活检显示28 d后人体肠道中仍然存在LGG[10]。

1.3抑制病原菌 抗生素是抑制并杀灭病原菌的重要方法，然而抗生素的使用伴随着细菌耐药、机体肠道菌群失衡等诸多隐患。抑制有害菌生长是益生菌维持肠道菌群平衡的一种方式。目前的研究表明LGG对沙门氏菌、大肠杆菌、白色念珠菌等病原菌的生长具有良好的抑制作用[11-13]。LGG能够有效地抑制大肠杆菌生物膜的形成，促进大肠杆菌被机体清除[14]。同时，LGG通过维持肠道菌群稳态，调节肠道先天性免疫和产生乳酸来抵抗肠道沙门氏菌感染[12，15-16]。此外，LGG能够以阻断黏附和营养消耗的方式保护口腔免受白色念珠菌的感染[13]。另外，目前已鉴定出7个LGG来源的抗菌活性多肽，均具有对革兰阴性菌和阳性菌的杀菌活性[17]。

2 LGG在CVD中的潜在作用机制

2.1抗炎 慢性炎症是CVD的重要诱发因素，抑制炎症相关信号通路、下调炎症介质是降低CVD发病率的有效措施。核因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)是细胞重要的转录因子，介导多种炎症因子如白介素-6(interleukin 6,IL-6)、白介素-8(interleukin 8,IL-8)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)的产生。Li等[18]发现LGG来源的可溶性蛋白HM0539通过下调Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)通路来抑制远端NF-κB激活。Tong等[19]发现LGG来源的膜外囊泡(extracellular vesicles,EVs)能够改善肠道炎症，这主要与其抑制TLR4-NF-κB通路激活有关。Mao等[20]的研究表明LGG通过抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/NF-κB通路减轻脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的炎症。此外，目前的研究表明LGG来源EPS、表层蛋白均能抑制NF-κB、MAPK等信号传递，同时下调炎症因子TNF-α、IL-6[21]。LGG来源的EVs、HM0539、EPS、表层蛋白是其发挥抗炎功能的主要角色。

2.2抗氧化应激 氧化应激过程是CVD发生发展的重要环节。氧化应激通过激活蛋白激酶C、NF-κB、肾素-血管紧张素-醛固酮系统等途径，诱导炎症、动脉粥样硬化、心肌纤维化等，最终引起严重的心功能障碍[22]。机体活性氧(reactive oxygen species,ROS)与抗氧化剂、自由基清除剂的失衡是氧化应激产生的直接原因。有证据表明，LGG来源的EPS能够有效地清除羟基、超氧阴离子等自由基，并通过Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1,Keap1)/核因子红血球相关因子-2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)通路减轻过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)诱导的猪肠道上皮细胞损伤[23]。Walia等[24]发现LGG能够恢复二甲基肼处理后大鼠体内的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽等水平，从而激活抗氧化系统，抵御氧化应激。同时体外研究表明，LGG能够降低H2O2诱导的人结直肠腺癌细胞中的氧化应激水平，并下调肿瘤坏死因子、早期生长应答因子2等氧化应激相关基因的表达，最终降低细胞内ROS水平[25]。

2.3保护肠道屏障 肠道菌群紊乱可引起肠道屏障受损导致肠道微生物易位，加速CVD进程[26-27]。肠道黏液层是肠道屏障的重要组成部分，也是抵御病原微生物的重要防线。黏蛋白-2(mucin 2，MUC-2)是生成肠道黏液层的关键。现有的研究表明LGG及其来源的可溶性蛋白P40能够促进肠道MUC-2的表达从而保护肠道屏障，防止肠道微生物易位[28-29]。闭锁小带蛋白1(zonula occludens 1,ZO-1)对维持肠道细胞紧密连接，保持肠屏障完整具有重要的意义。Miyauchi等[30]发现LGG通过上调ZO-1的表达减轻肿瘤坏死因子诱导的肠道上皮细胞损伤，保护屏障的完整性。促进黏蛋白及紧密连接蛋白的表达是LGG保护肠道屏障的主要机制。

2.4调节肠道菌群 肠道菌群是宿主维生素合成、食物消化的主要角色，对宿主健康具有重要作用。肠道菌群失调即肠道微生物数量和种类的改变，通过诱导宿主炎症和代谢紊乱促进CVD的进展。LGG可以通过增加有益菌，减少有害菌并调节失衡的肠道菌群，在维持健康的肠道环境的同时降低疾病风险。Chen等[31]对脓毒症小鼠补充LGG的研究发现，LGG能够逆转脓毒症引起的菌群紊乱，抑制变形杆菌等条件致病菌的同时，上调对肠屏障有益的阿克曼式菌属。Ni等[32]的研究表明，结直肠癌癌前病变小鼠模型补充LGG可以抑制沃式嗜胆菌等炎症相关菌且上调肠道中罗氏菌属的数量。因此，LGG可能通过调节动脉粥样硬化、高血压、心力衰竭等引起的肠道菌群失衡，减缓CVD的进展。

2.5调节肠道菌群代谢物 通过调节菌群代谢物的生成影响宿主是肠道菌群-宿主相互作用的主要方式。大量的研究表明肠道菌群来源的氧化三甲胺(trimethylamine-N-oxide,TMAO)、LPS、短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)等代谢物通过调节炎症等过程影响CVD进展。LGG可能通过调节菌群代谢产物的生成影响CVD。

2.5.1 TMAO TMAO是食物中的胆碱、左旋肉碱等经过肠道菌群代谢、肝脏转化等过程生成的小分子活性代谢物，是包括动脉粥样硬化在内多种CVD的启动因素。近年来，一系列的临床试验证实血清TMAO及其相关代谢物水平与CVD风险呈显著正相关(P<0.05)[33]。目前的研究表明TMAO是急性冠脉综合征不良预后的独立预测因子，同时也是心力衰竭患者死亡的重要影响因素[34-35]。补充益生菌调节肠道菌群是下调机体TMAO水平的潜在方法。然而临床试验表明干酪样乳杆菌、益生菌复合制剂对TMAO的生成均无显著影响(P>0.05)[36-37]。Liu等[38]的研究发现，缺氧联合高盐饮食的大鼠模型中TMAO水平显著上升，而LGG的补充能下调该模型中大鼠血浆TMAO水平，LGG如何调节TMAO水平尚有待进一步研究。

2.5.2 LPS 肠道菌群紊乱引起LPS产生增加，LPS通过TLR4直接作用于心肌成纤维细胞、巨噬细胞等引起下游炎症[39]。LGG通过调节肠道菌群减少LPS产生相关肠道微生物的数量。研究发现，补充LGG能够逆转脓毒症小鼠肠道菌群失调，同时减少脓毒症小鼠体内肠杆菌科、拟杆菌科以及丹毒杆菌科等与LPS产生密切相关的微生物群[31，40]。

2.5.3 SCFAs SCFAs(包括甲酸、乙酸、丙酸和丁酸等)主要由肠道微生物发酵膳食纤维产生，是肠道最为丰富的菌群代谢产物。补充SCFAs有助于改善高血压及其并发症，抑制载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化的进展[41]。Tyagi等[42]发现口服LGG后小鼠肠道内产丁酸的梭菌丰度上升，肠道和血液丁酸水平显著升高。有研究发现添加LGG显著提高食物过敏婴儿肠道内产丁酸盐菌株丰度，提高粪便中丁酸盐水平[43]。Lin等[44]的研究也表明LGG通过提高拟杆菌门丰度和促丁酸产生基因的表达来促进丁酸产生。调节产SCFAs菌丰度、影响SCFAs合成的相关基因是LGG调节SCFAs产生的主要机制。

3 LGG在CVD中的应用

3.1动脉粥样硬化 动脉粥样硬化是心肌梗死、脑梗死等多种心脑血管疾病的病理学基础，是引起心血管事件的关键因素。动脉粥样硬化的形成机制十分复杂，主要涉及炎症、氧化应激等多个过程。Schoemaker等[45]通过对高脂饮食诱导的动脉粥样硬化小鼠模型补充益生菌配方(LGG、二十二碳烯酸、水解酪蛋白、花生四烯酸)，发现该配方能显著减轻肥胖小鼠体内白色脂肪炎症，改善小鼠胰岛素抵抗，降低血浆胆固醇、甘油三酯，同时显著抑制小鼠动脉粥样硬化的进展。Chan等[46]发现对高脂饮食诱导的小鼠动脉粥样硬化模型补充LGG能够显著减小其主动脉窦和主动脉弓的动脉粥样硬化斑块，同时下调血浆中动脉粥样硬化危险因子如胆固醇、可溶性E-选择素和内毒素等。

3.2心肌梗死 急性心肌梗死是以心肌细胞缺血缺氧死亡为特征的严重心血管急症。减轻缺血缺氧对心肌细胞的影响，改善心肌梗死后心力衰竭等并发症，对降低心肌梗死的病死率有重要意义。热休克蛋白(heat shock protein 70,HSP70)在保护心脏免受各种损伤方面发挥关键作用。Zhao等[47]的研究表明LGG来源的可溶性蛋白P75通过结合HSP70羧基末端反应蛋白，阻止其对HSP70的抑制作用，进而确保HSP70发挥心肌细胞保护作用，最终缓解缺血/缺氧诱导的心肌梗死，预防心脏细胞损伤。Xu等[48]的研究表明LGG及LGG培养上清液均能够通过抗氧化应激途径保护缺氧诱导的心肌重塑并降低心肌炎症，进而发挥心脏保护作用。LGG对心肌梗死的保护机制还需进一步研究。

3.3高脂血症 高脂血症是机体脂质代谢紊乱引起的病理性状态。高脂血症能够促进动脉粥样硬化的发生、发展，是CVD的传统危险因素。LGG通过影响胆固醇合成及排泄来维持机体血脂稳态，降低CVD风险。Kim等[49]通过对高脂饮食喂养的小鼠补充LGG发现，LGG能够调节胆固醇合成和外排基因的表达，同时上调肝脏胆固醇7α-羟化酶，促进胆固醇向胆汁酸转化。Kumar等[50]的研究表明，LGG或LGG联合芦荟凝胶可显著降低高胆固醇血症小鼠的血液总胆固醇和低密度脂蛋白水平，同时LGG联合芦荟凝胶还能提高高胆固醇血症小鼠的血液高密度脂蛋白水平。另外，Zhang等[51]发现LGG来源EPS能够显著降低高脂饮食诱导的小鼠体内甘油三酯水平，改善脂质代谢紊乱。

3.4高血压 高血压是以血压升高为特点，受多因素影响的心血管综合征，是心脑血管疾病最重要的危险因素。尽管关于高血压的发生机制在不断更新，目前仍有90%的高血压发生机制无法阐明。近年来的研究表明，TMAO水平与高血压的发生风险呈正相关，TMAO通过调节脂质代谢、糖代谢和炎症途径影响高血压的发生[52]。Liu等[38]采用高盐饮食联合慢性间歇性缺氧的方法诱导大鼠高血压模型，发现高盐+间歇性缺氧环境通过增加血液TMAO水平、释放干扰素-γ、转化生长因子-β来增加高血压严重程度，LGG通过降低血液TMAO水平、调节辅助性T细胞1/辅助性T细胞2的比例、抑制胞外调节蛋白激酶1/2、蛋白激酶B的磷酸化来预防高血压的恶化。

3.5肥胖 肥胖是心力衰竭、心房颤动、动脉粥样硬化等CVD的高危因素，健康人群维持适当体重可降低CVD发生风险[53]。LGG通过自身EPS或刺激机体脂联素分泌发挥抗肥胖作用。Zhang等[51]研究表明LGG来源的EPS能够显著抑制小鼠体内Toll样受体2(Toll-like receptor 2，TLR2)介导的脂肪生成，敲除TLR2后EPS对脂肪生成的抑制作用消失。脂联素是一种主要由白色脂肪分泌的脂肪因子，能够促进脂肪酸氧化。Kim等[54]的研究表明LGG能够刺激小鼠脂联素分泌进而激活腺苷酸活化蛋白激酶，加速葡萄糖摄取和脂肪酸氧化，减轻高脂饮食诱导的小鼠体重增加。

3.6糖尿病 糖尿病患者长期高血糖状态可能导致脂质蛋白质结构和功能改变，增强机体氧化应激，进而增加CVD发生风险[55]。一项随机研究表明LGG可改善糖尿病患者的血糖，维持机体血糖以及糖化血红蛋白的水平[56]。Wang等[57]的研究表明口服LGG可降低糖尿病小鼠模型空腹及餐后血糖水平，提高糖耐量，防止胰腺损伤。Park等[58]发现LGG的补充显著提高了糖尿病小鼠的糖耐量，LGG的抗糖尿病效应与其缓解内质网应激以及抑制巨噬细胞活化相关。此外，Park等[59]发现LGG的补充能够显著逆转高脂饮食喂养小鼠体内的胰岛素抵抗。LGG主要通过降低血糖，提高糖耐量和减轻胰岛素抵抗在糖尿病中发挥心血管保护作用。

4 LGG的有效性和安全性争议

目前，关于LGG的有效性和安全性存在争议，多项高质量研究的结果之间相互矛盾。既往的研究表明LGG的补充能够显著缩短急性胃肠炎患者腹泻持续时间以及住院时间，同时能够降低中重度疾病的发病率[60-61]。然而，近期一项大型前瞻性试验表明，补充LGG未能对急性胃肠炎儿童带来任何额外益处[62]。新近的研究对LGG能否预防呼吸机相关肺炎提出了质疑。既往的研究表明益生菌可降低25%～30%的呼吸机相关肺炎感染风险[63-64]。一项多中心随机对照试验表明LGG对呼吸机相关肺炎的发生率并无显著影响[65]。LGG在特定疾病环境中的有效性尚需更多研究来证实。LGG的安全性近年来备受关注。有学者认为益生菌虽被定义为能使机体获益的活体微生物，但其作为微生物具有的机会性感染特性不容忽视。菌血症是目前益生菌干预最常见的不良事件，血液病原菌分离表明LGG占比最多[66]。有证据表明接受LGG治疗的重症患者菌血症的发生率显著高于不接受LGG治疗的重症患者，LGG能够直接导致菌血症并在患者体内适应性进化[67]。同时在炎症性肠病、主动脉瓣膜置换术后的患者中均出现LGG引起菌血症的病例报道[68-69]。LGG菌血症发生率高的原因还需要进一步研究。此外，目前关于LGG的安全性争论还出现在癌症的免疫治疗领域。Si等[70]对大肠癌和黑色素瘤小鼠模型补充LGG，结果发现LGG能够通过增加肿瘤中的树突状细胞和T细胞数量来增强PD-1免疫治疗的抗肿瘤效果。然而，近期Spencer等[71]发现口服LGG的黑色素瘤小鼠模型体内肿瘤明显增大，且小鼠肿瘤中干扰素-γ阳性CD8+T细胞的浸润率显著下降，推测不适当地补充益生菌可能导致癌症患者免疫功能受损。LGG能否增强癌症免疫治疗效果尚存疑。近年来，越来越多的证据表明在器官衰竭、免疫功能低下、使用免疫抑制剂、肠道屏障机制障碍的患者中需谨慎使用益生菌[72]。目前，虽然LGG在特殊人群中的不良作用已被广泛报道，但其能对机体产生多种益处不容置疑。在特殊人群中应当谨慎使用LGG。LGG在特定疾病中的有效性和安全性还需要大量研究进一步验证。

5 结语

肠道菌群是未来CVD治疗的潜在有效靶点。LGG因自身优越的抗炎、抗氧化应激等特性成为了靶向肠道预防和治疗CVD的重要候选菌株。然而，目前针对LGG与CVD的研究较少且大多停留在动物实验阶段，尚无基于人群的大型临床试验证实。另外，目前LGG安全性争议还在持续，LGG对CVD的有效性和安全性还需要大型临床试验进一步验证。目前的研究表明，LGG来源的EVs、P40、P75、HM0539、EPS、表层蛋白等在LGG的疾病保护作用中扮演着重要角色，但这些物质通过何种机制发挥疾病的保护作用尚不够明确。在明确LGG的心血管保护作用的同时，确定LGG产生心血管保护作用的关键成分并揭示其作用机制是未来研究的关键，同时对避免LGG治疗相关不良反应(如菌血症)也有重要的意义。此外，进一步研究LGG发挥心血管保护作用的最佳剂量、使用时间和产生的副作用等对未来指导LGG临床应用至关重要。完整的益生菌安全性评价体系、严格的益生菌治疗指南、明确的益生菌作用机制和客观的益生菌不良反应的描述是未来LGG在临床广泛应用前必须满足的条件。