温阳解毒化瘀方对慢加急性肝衰竭大鼠肝组织M1/M2型巨噬细胞免疫失衡的调控研究

郝若冰　谭年花　刘子情　陈斌

【摘要】 目的：研究溫阳解毒化瘀方对慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）大鼠肝组织M1/M2型巨噬细胞表达的影响，探讨其对ACLF炎症反应可能的调控机制。方法：将60只SD大鼠适应性喂养6 d后，随机选取6只为空白组，余54只建立ACLF大鼠模型，共成模36只，随机将其分为模型组（蒸馏水）、中药组（温阳解毒化瘀方），各18只。采用牛血清白蛋白致敏法建立免疫性肝纤维化大鼠模型，然后通过D-半乳糖（D-Gal）联合脂多糖（LPS）腹腔注射急性攻击建立ACLF大鼠模型，并分别予以相应干预。观察各组大鼠急性攻击后1、12、24 h肝组织病理学形态改变及M1/M2型巨噬细胞极化状态。结果：与空白组比较，模型组肝组织病理评分在攻击后1、12、24 h均升高（P<0.05），并且随着时间的进展，肝组织病理学评分逐渐升高。与模型组比较，中药组在攻击后1、12、24 h病理评分均降低（P<0.05）。与空白组比较，模型组CD68、iNOS、Arg-1及CD206在攻击后1、12、24 h均明显增加（P<0.01）。与模型组比较，中药组在攻击后各时间点CD68和iNOS均减少，而Arg-1和CD206均增加（P<0.05）。与空白组比较，模型组CD68、iNOS、Arg-1和CD206 mRNA在攻击后1、12、24 h均显著上调（P<0.01）。与模型组比较，中药组iNOS、CD68 mRNA在攻击后1、12、24 h均下调，而Arg-1、CD206 mRNA均上调（P<0.05）。结论：ACLF大鼠存在M1/M2型巨噬细胞表达失衡，其失衡程度与肝损伤严重程度相关。温阳解毒化瘀方能够改善ACLF大鼠肝组织损伤，其机制可能与上调CD206、Arg-1，抑制CD68、iNOS的表达，诱导巨噬细胞由M1型向M2型极化，减轻ACLF炎症反应有关。

【关键词】 温阳解毒化瘀方 慢加急性肝衰竭 M1型巨噬细胞 M2型巨噬细胞

Regulation of Wenyang Jiedu Huayu Prescription on Immune Imbalance of M1/M2 Macrophages in Liver Tissue of Chronic Acute Liver Failure Rats/HAO Ruobing， TAN Nianhua， LIU Ziqing， CHEN Bin. //Medical Innovation of China， 2022， 19（11）： 0-028

[Abstract] Objective： To investigate the effect of Wenyang Jiedu Huayu Prescription on the expression of M1/M2 macrophages in liver tissue of acute on-chronic liver failure （ACLF） rats， and to explore its possible regulatory mechanism on the inflammatory response of ACLF. Method： A total of 60 SD rats were fed adaptively for 6 d， 6 rats were randomly selected as blank group， and the remaining 54 rats were randomly divided into model group （distilled water） and traditional Chinese medicine group （Wenyang Jiudu Huayu Prescription）， 18 rats in each group. The rat model of immune liver fibrosis was established by bovine serum albumin sensitization method， and then ACLF rat model was established by acute attack by D-galactose （D-Gal） combined with lipopolysaccharide （LPS） injection， and corresponding intervention was given respectively. The histopathological morphological changes and polarization status of M1/M2 macrophages were observed at 1， 12 and 24 h after acute attack. Result： Compared with the blank group， the liver histopathological scores of the model group increased at 1， 12 and 24 h after attack （P<0.05）， and the liver histopathological score increased gradually with time. Compared with model group， the liver histopathological scores of traditional Chinese medicine group were decreased at 1， 12 and 24 h after attack （P<0.05）. Compared with blank group， CD68， iNOS， Arg-1 and CD206 in model group were significantly increased at 1， 12 and 24 h after attack （P<0.01）. Compared with model group， CD68 and iNOS were decreased at each time point after attack， while Arg-1 and CD206 were increased in traditional Chinese medicine group （P<0.05）. Compared with blank group， CD68， iNOS， Arg-1 and CD206 mRNA in model group were significantly up-regulated at 1， 12 and 24 h after attack （P<0.01）. Compared with model group， mRNA of iNOS and CD68 were down-regulated at 1， 12 and 24 h after attack， while mRNA of ARG-1 and CD206 were up-regulated in traditional Chinese medicine group （P<0.05）. Conclusion： The expression imbalance of M1/M2 macrophages is found in ACLF rats， and the degree of imbalance is related to the severity of liver injury. Wenyang Jiedu Huayu Prescription can improve the liver tissue injury of ACLF rats， and the mechanism may be related to the up-regulation of CD206 and ARG-1， the inhibition of CD68 and iNOS expression， the induction of macrophage polarization from M1 to M2， and the alleviation of ACLF inflammation.

[Key words] Wenyang Jiedu Huayu Prescription Acute-on-chronic liver failure M1 macrophages M2 macrophage

First-author’s address： Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.11.006

慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure， ACLF）是在慢性肝病的基础上产生严重肝功能失代偿的一种临床综合征，在其发展过程中，机体的免疫系统被激活，免疫微环境紊乱，大量肝细胞变性、坏死，肝功能失常[1]。课题组前期经大量临床实践及研究证实温阳解毒化瘀方能显著改善肝衰竭肠源性内毒素血症和调节细胞免疫功能，具有较好的临床应用前景[2-3]。而肝脏巨噬细胞（Kupffer细胞）作为肝脏局部免疫的重要组成部分，参与着肝脏免疫内环境的变化过程，依肝脏微环境的改变，表现出促炎M1型和抗炎M2型不同的极化状态，二者平衡调控肝脏炎症反应，其平衡倾向决定了炎症是持续进展还是可逆恢复。研究发现，调控肝脏巨噬细胞的极化状态对减轻肝衰竭炎症反应、控制病情进展发挥着重要作用，但其作用机制有待深入研究。本研究基于M1/M2型巨噬细胞极化的理论角度，通过构建ACLF大鼠模型，探讨温阳解毒化瘀方治疗肝衰竭炎症反应的免疫学机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 60只健康SD雄性大鼠，体重130～150 g，采购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2019-0004。大鼠集中喂养于湖南中医药大学动物实验中心，饲养温度19～23 ℃（最大日温差距<4 ℃），相对湿度55%～70%，进食普通饲料，饮用蒸馏水。

1.2 药物与试剂 中药温阳解毒化瘀方，所有中药材均购来自华润三九医药股份有限公司，方中茵陈30 g（批号：2006006C），丹参30 g（批号：2005005S），赤芍60 g（批号：2012003C），白术30 g（批号：2008003C），薏苡仁30 g（批号：2009002S），附片10 g（批号：1911003C）。D-半乳糖（D-Gal）、脂多糖（LPS）、弗氏不完全佐剂（Sigma公司，批号：420K0521、111C033、1002453350），无水乙醇、二甲苯、正丁醇、中性树胶、三氯甲烷、异丙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号：100092683、10023418、100052190、10004160、10006818、80109218），柠檬酸（pH 6.0）抗原修复液、牛血清白蛋白、正常兔血清、苏木素染液、苏木素分化液、苏木素返蓝液、组化试剂盒DAB显色剂、Servicebio RT First Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Green qPCR Master Mix（none ROX）（Servicebio公司，批号：G1202、G5001、G1209、G1004、G1309、G1340、G1211、G3330、G3320），RNA提取液（ambion公司，批号：15596-026），HyPureTMMolecular Biology Grade Water（HyClone公司，批號：SH30538.02）。

1.3 仪器 电化学发光全自动免疫分析仪（Roche Diagnostics Gmbh， cobas 8000型）;脱水机（DIAPATH，型号：Donatello）;包埋机（武汉俊杰电子有限公司，JB-P5型）;病理切片机（上海徕卡仪器有限公司，RM2016型）;冻台（武汉俊杰电子有限公司，JB-L5型）;组织摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，KD-P型）;烤箱（上海慧泰仪器制造有限公司，DHG-9140A型）;盖玻片（江苏世泰实验仪器有限公司，10212432C型）;脱色摇床（Servicebio，TSY-B型）;涡旋混合器（Servicebio，MX-F型）;组化笔（Servicebio，D1008E型）;显微镜（Nikon，E100型）;成像系统（日本尼康，Nikon DS-U3）;荧光定量PCR仪（Bio-rad，CFX型）;超微量分光光度计（Thermo，NanoDrop2000型）;标准试剂型纯水仪（青岛富勒姆科技有限公司，FBZ2001-up-p型）。

1.4 分组、造模与干预 将60只SD大鼠适应性喂养6 d后，随机选取其中6只为空白组，余54只建立ACLF大鼠模型。（1）建立免疫性肝纤维化大鼠模型：参考文献[4]通过牛血清白蛋白致敏法建立免疫性肝纤维化大鼠模型，分4次使用0.5 mL牛血清白蛋白乳化液（牛血清白蛋白含量4 mg）分别于第1、15、25、35天皮下多点注射致敏，继而使用尾静脉注射，每周2次，共12次，牛血清白蛋白剂量从2 mg/次开始逐渐递增，每次递增

0.5 mg/次，至4 mg/次后保持，持续6周。在牛血清白蛋白致敏阶段死亡18只，共成模36只，随机将其分为模型组（蒸馏水）、中药组（温阳解毒化瘀方），各18只。（2）灌胃干预：根据参考文献[5]，大鼠与人的给药剂量系数为6.17，计算得到中药组生药用量为19.538 g/kg，换算成大鼠每日颗粒剂量为3.57 g/kg，将中药颗粒配置为0.338 g/mL的溶液，按照1.056 mL/100 g进行中药灌胃干预，1次/d，共持续1周至急性攻击前。其余两组使用等剂量蒸馏水灌胃。（3）急性攻击建立ACLF大鼠模型：取

D-Gal+LPS液（含D-Gal 400 mg/kg，LPS 100 μg/kg）

对模型组和中药组进行腹腔注射急性攻击建立ACLF大鼠模型，并对空白组注射等量0.9%NaCl溶液，1 h处死空白组并采集肝组织标本，其余两组分别于腹腔攻击后1、12、24 h处死并采集肝组织标本，共成功采集空白组标本6只，模型组、中药组1、12、24 h标本各6只。

1.5 观察指标

1.5.1 肝组织HE染色 依次将大鼠肝组织切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ内分别浸泡20 min，后放入无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ内分别浸泡5 min，75%酒精内浸泡5 min，用水冲洗后置于苏木素染液染5 min，水洗后使用分化液分化，再次水洗，使用返蓝液返蓝，流水冲洗后依次放入85%、95%酒精脱水5 min，伊红染色液中染色5 min后脱水封片。参考文献[6-8]评分，按肝组织损伤程度及范围的不同，肝组织结构正常计0分;肝细胞点状坏死计1分;肝细胞呈灶状或片状坏死，占小叶1/3以内计2分;肝细胞呈广泛坏死伴出血，占小叶1/3～2/3计3分;肝细胞坏死占小叶2/3以上计4分。

1.5.2 免疫组化法检测肝组织M1型巨噬细胞标志物（iNOS、CD68）和M2型巨噬细胞标志物（Arg-1、D206）的表达 将大鼠肝组织标本置入二甲苯浸泡15 min，三次后依次在100%、85%和75%乙醇浸泡5 min，随后蒸馏水清洗。完成脱蜡后将组织切片置于装有柠檬酸抗原修复液（pH 6.0）的修复盒中热抗原修复，自然冷却后使用PBS液（pH 7.4）洗涤3次。随后将切片置于3%双氧水溶液中，室温下避光孵育25 min后置玻片于PBS液（pH 7.4），使用脱色摇床晃荡清洗3次，各5 min。使用山羊非免疫血清封闭30 min后甩去封闭液，在切片上滴加50 μL一抗稀释液，4 ℃过夜孵育，室温复温40 min，PBS洗涤3次，每张切片滴加50 μL与一抗相应种属的二抗稀释液，避光状态下室温孵育50 min，PBS洗涤3次。随后滴加DAB显色液50 μL显色，后使用苏木素复染细胞核，脱水、封片后使用显微镜镜检，使用NIS-Elements AR Analysis 4.50.00 软件采集免疫荧光标本图像并计数。

1.5.3 RT-qPCR法测定肝组织M1型巨噬细胞标志物（iNOS、CD68）和M2型巨噬细胞标志物（Arg-1、D206）的基因表达 取大鼠肝组织约100 mg，加入1 mL的RNA提取液并置入匀浆管中，使用匀浆仪充分研磨充分后离心取上清;加入250 μL三氯甲烷，充分混匀后静置3 min，低温离心10 min;后将400 μL上清加入0.8倍体积的异丙醇混匀，与-20 ℃下静置15 min，低温离心10 min后弃上清;1.5 mL 75%乙醇清洗沉淀，离心5 min，弃上清;将沉淀置于室温干燥5～10 min;使用15 μL无RNA酶的水将沉淀溶解，多功能酶标仪测定浓度及纯度，并按照合适比例稀释浓度过高的RNA，使得其最终浓度为100～500 ng/μL。然后逆转录得到cDNA，在Bio-rad公司CFX荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR，引物序列见表1。

1.6 统计学处理 所有数据采用SPSS 25.0软件进行统计分析处理，计量资料用（x±s）表示，釆用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行多组间比较，使用LSD-t检验法进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有高度统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况观察 D-Gal+LPS液急性攻击后，模型大鼠出现精神不振，行动迟缓，部分大鼠食量、活动量减少，对刺激的反应减弱。模型组与中药组均于攻击后24 h各死亡1只（发现死亡时立即取材，标本采集顺利），死亡率均为5.6%（1/18）。空白组无死亡，毛发光泽，精神状态良好。

2.2 各组大鼠肝组织病理学比较 空白组可见大鼠肝组织小叶结构正常，肝细胞排列有序，界限较清，形态正常;中央静脉清晰可见，肝血窦正常;未见肝细胞坏死及炎性浸润等。模型组可见大鼠肝组织结构遭到广泛破坏，小叶结构不明显，部分肝细胞已消失，胞质嗜酸性减少，并被大量增生的纤维组织及炎性细胞代替。假小叶形成，出现大量变性、坏死的肝细胞。门管区有炎性细胞浸润，伴部分小胆管及纤维组织增生，随着时间进展，肝组织坏死及炎性浸润逐渐加重;其变化符合ACLF病理诊断[9]。中药组大鼠肝组织结构破坏程度较ACLF大鼠有所减轻，肝组织内少量纤维组织增生及炎性细胞浸润，部分肝细胞变性，坏死，坏死区域较少，以点状坏死为主，肝小叶结构保留，随着时间进展，肝组织坏死及炎性浸润有所减轻。见图1。

2.3 各组肝组织病理学评分变化 与空白组比较，模型组肝组织病理评分在攻击后1、12、24 h均升高（P<0.05），并且随着时间的进展，肝组织病理学评分逐渐升高。与模型组比较，中药组在攻击后1、12、24 h病理评分均降低（P<0.05）。见表2。

2.4 各组iNOS、CD68和Arg-1、CD206表达情

况 与空白组比较，模型组CD68、iNOS、Arg-1及CD206在攻擊后1、12、24 h均明显增加（P<0.01）。与模型组比较，中药组在攻击后各时间点CD68和iNOS均减少，而Arg-1和CD206均增加（P<0.05）。见表3、4。

2.5 各组iNOS、CD68和Arg-1、CD206基因表达情况 与空白组比较，模型组CD68、iNOS、Arg-1和CD206 mRNA在攻击后1、12、24 h均显著上调（P<0.01）。与模型组比较，中药组iNOS、CD68 mRNA在攻击后1、12、24 h均下调，而Arg-1、CD206 mRNA均上调（P<0.05）。见表5、6。

3 讨论

肝衰竭属于现代医学名词，其发病机制复杂，且病情危重，传统医学依据其黄疸表现大多从阴阳辨证，将其归于“瘟黄”“黄疸”“急黄”等概念[10]。但在肝衰竭疾病进展过程中，尤其是病程进展至后期，临床表现逐渐由“湿热瘀毒”等单纯的标实表现转化为湿、热、瘀、毒与阳虚、气虚并存，脾虚、阳虚的表现逐漸显现，呈现出“阴阳黄”的状态[11-12]。课题组在长期临床实践中基于“阳黄-阴阳黄-阴黄”的理论体系，在清热解毒，凉血利湿的诊疗思路上，辨证地加用温阳健脾、益气和胃之法早期干预，将肝衰竭的中医治法逐渐优化为“清温并用法”，并创温阳解毒化瘀方。前期已有许多相关研究证实其能够有效降低肝衰竭的病死率，效果优于单纯的清热化湿法[13-14]。并发现温阳解毒化瘀方治疗肝衰竭的作用机制可能与调节ACLF发病过程中抑炎与促炎作用失衡有关。参与炎症反应的巨噬细胞具有较强的可塑性，可被不同炎症因子诱导分化，在不同微环境的刺激影响下，极化为M1型和M2型巨噬细胞;其中M1型巨噬细胞具有产生促炎因子、增强机体适应性免疫的作用;M2型巨噬细胞可以大量释放血管内皮细胞生长因子、精氨酸酶-1、转化生长因子-β和IL-10等细胞因子，在血管生成、分泌抗炎因子、促进组织损伤修复及重塑方面起着重要作用[15-18]。近年来巨噬细胞极化的相关研究逐步深入，已有研究证实肝脏巨噬细胞是肝损伤急性发病机制的核心[19]，巨噬细胞极化及其细胞因子的分泌在肝衰竭发病机制中占据重要地位，调节巨噬细胞极化则成为肝脏炎性疾病治疗的重要机制。

本研究以牛血清白蛋白致敏法联合D-半乳糖胺+脂多糖急性攻建慢加急性肝衰竭大鼠为模型，造模后与空白组比较，模型组大鼠HE染色显示模型组大鼠肝组织结构广泛性破坏，肝细胞大量变性、坏死，出现弥漫性炎症浸润及纤维组织增生，肝组织病理评分、CD68、iNOS、CD206、Arg-1表达均明显上升。经清温并用法治疗后，与模型组比较，大鼠肝组织破坏程度及炎症细胞浸润程度明显减轻，肝组织病理评分、CD206、Arg-1表达上升，CD68、iNOS表达下调，M1/M2型极化向M2型偏移。从研究结果分析显示，ACLF发生时肝脏的炎性微环境能够促使巨噬细胞向M1型极化，这一结果与王俊[20]的研究结果基本一致，其认为ACLF发生时，免疫系统被过度激活，肝脏浸润的巨噬细胞分泌大量促炎因子和趋化因子使巨噬细胞向M1型极化，经过反复级联，机体免疫微环境内稳态严重失衡，从而造成全身炎症反应综合征，并致使ACLF病情进一步加重。而温阳解毒化瘀方可改善肝衰竭大鼠肝损伤，可能与促进巨噬细胞向M2型极化有关。

综上所述，温阳解毒化瘀方能够改善慢加急性肝衰竭大鼠肝脏炎症反应，减轻肝损伤，机制可能与其能上调CD206、Arg-1表达，促进巨噬细胞向M2型极化有关，此项研究在中医药防治肝衰竭领域提供新的治疗思路，但是否还存在其他调控方式仍有待更进一步研究。

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（收稿日期：2020-03-04） （本文编辑：田婧）