二氯喹啉酸和莠去津诱导烟草保护酶活性变化

彭梁睿 郜军艺 李彩斌 肖艳松 肖志鹏 方松 刘雪 张继光 孔凡玉

摘要：为阐明二氯喹啉酸和莠去津影响烟草生长发育的酶学机制，以K326为供试烟草品种，利用水培试验研究不同浓度二氯喹啉酸（0、0.000 3、0.001 2、0.004 8、0.009 6 g/L）和莠去津（0、0.001、0.003、0.009、0.012 g/L）对烟草幼苗根系发育和保护酶系统过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）的影响。结果表明，烟苗根系生长受二氯喹啉酸和莠去津胁迫浓度和胁迫时间的影响，其中最高浓度的二氯喹啉酸（0.009 6 g/L）和莠去津（0.012 g/L）对烟草根系的胁迫作用最大;且2种除草剂能显著影响烟苗保护酶系统活性，除SOD在除草剂的长时间胁迫下出现酶活性降低情况外，各浓度二氯喹啉酸和莠去津的处理组与对照组相比，烟苗的POD和APX活性均不同程度提高，且除草剂浓度越高，各酶活性越高。后续试验将进一步探究二氯喹啉酸和莠去津对田间烟草发育、酶活性及代谢方面的影响，为揭示烟草药害的机制并提高烟草抗药害能力提供理论和技术支撑。

关键词：烟草;二氯喹啉酸;莠去津;化学胁迫;保护酶系统;酶活性

中图分类号：S435.72   文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2022）07-0078-06

收稿日期：2021-10-28

基金项目：中国农业科学院科技创新工程（编号：ASTIP-TRIC06）;贵州省毕节市烟草公司科技项目（编号：2020520500240072）;湖南省烟草公司郴州市公司科技项目（编号：2019431000240098）;湖南省烟草公司衡阳市公司科技项目（编号：2020430400240090）。

作者简介：彭梁睿（1997—），男，湖南长沙人，硕士研究生，研究方向为食品风险与评估。E-mail：plr2581@163.com。

通信作者：孔凡玉，硕士，研究员，研究方向为烟草质量安全风险评估、病虫害测报及综合防治。E-mail：kongfanyu@caas.cn。

二氯喹啉酸和莠去津是我国农田应用广泛的2种除草剂，对农田稗草及其他禾本科杂草均具有较好的防除效果[1-3]，但是不合理施用会造成农药残留，对农作物生长及其土壤环境造成严重不良影响[4]。由于二氯喹啉酸和莠去津在土壤中的代谢周期长，前茬作物施用易对后茬烟草等敏感作物产生药害[5]，导致植株矮化黄化、发育迟缓和生长畸形等，而且药害产生后难以挽救，严重影响烟草的产量和品质，给烟叶生产造成重大经济损失和安全风险[6]。

二氯喹啉酸属于喹啉羧酸类激素型选择性除草剂，其作用机制是通过植物根部吸收进入植株体内，诱导1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）大量形成，随后在ACC氧化酶的作用下生成大量的乙烯，同时产生等量的氰化物，氰化物阻断叶绿体及线粒体中电子传递，最终导致活性氧在植物体内大量积累[7]。莠去津是一种三嗪苯类除草剂，可以抑制阔叶杂草的光合作用，使其枯死，广泛应用于防除高粱、甘蔗和玉米等田间的杂草[8]。莠去津极性大，易溶解于水，属于内分泌干扰剂物质，当莠去津施用到农田时，只有很少一部分被植物根吸收，大部分被淋洗到土壤中，而产生较长的持续性影响[9]。烟草对这2种除草剂非常敏感，它们主要通过影响烟草光合作用进而影响烟株生长发育[10]。目前有研究者开展了2种除草剂对烟草生长发育、药害分布特征及其防控修复方面的影响研究[11-12]，但对烟草体内保护酶系统的影响还较少涉及。

除草剂药害等环境胁迫能使植物细胞中积累大量的活性氧，活性氧超过阈值，就会引发或加剧脂膜的过氧化，进而对蛋白质、膜脂、DNA及其他细胞组分造成极大的损伤[13]。过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）是植株中活性氧清除系统的重要组成部分，POD具有分解活性氧H 2O 2的作用，可将H 2O 2分解為O 2和H 2O而使植株免受毒害作用。SOD是清除植物体内H 2O 2的重要保护酶，可以进行Haber-Weiss反应清除植物体内多余的 O- 2·，同时另一种植物活性氧代谢中重要的抗氧化酶APX也在清除H 2O 2的过程中起着极大的作用，尤其是在清除叶绿体中H 2O 2的过程中作用极大。POD、SOD与POD协同作用可清除具有潜在危害的 O- 2·和H 2O 2，从而保护细胞膜结构[14]。

本试验针对易对烟草产生药害的2种长残效除草剂二氯喹啉酸和莠去津，在控制除草剂浓度及相关环境条件下，通过水培试验模拟研究了其对烟草幼苗根系生长和烟草保护酶系统POD、SOD和APX等的影响，以期为深入探究除草剂在烟草体内的积累代谢及解毒等生理过程奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验地点为中国农业科学院烟草研究所即墨试验基地（116°44′E、39°92′N）温室，试验时间为2020年11月，供试烤烟品种为K326，试验用除草剂为25%二氯喹啉酸悬浮剂（江苏绿利来有限公司）和50%莠去津悬浮剂（山东胜邦绿野有限公司），试验所用营养液为10%霍格兰氏营养液。

1.2 试验设计

选取颗粒饱满的K326烤烟种子，用0.1%AgNO 3溶液消毒后，置于人工培养箱中育苗培养，当烟苗长至4～6张真叶时，挑选长势一致的烟苗，移栽到水培盒里进行水培。每个水培盒中营养液体积为4 L，移栽烟苗3棵，试验过程中使用充气泵通气2 h/d，每3 d更换1次霍格兰氏营养液，以维持营养液的成分相对稳定。

按照单因素多水平设计试验，除草剂不同处理二氯喹啉酸浓度梯度设为0、0.000 3、0.001 2、0004 8、0.009 6 g/L，分别记为CK、C 1、C 2、C 3、C 4;不同处理莠去津浓度梯度设为0、0.001、0.003、0009、0.012 g/L，分别记为CK、Y 1、Y 2、Y 3、Y 4。二氯喹啉酸和莠去津各处理浓度的设置是综合考虑其田间推荐施用量、积累量及损失情况后确定的，2种除草剂共用CK处理，各处理设置6次重复，在添加除草剂后的第5、第9、第14、第19、第24天，分别进行烟苗取样，测定其根系生长情况，并采集烟叶样品置入-80 ℃冰箱中，用于测定保护酶活性。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 POD活性测定 使用过氧化物酶试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司），参照说明书的试验方法，取0.1 g冷冻保存的叶片，按照组织质量 ∶提取液体积为1 g ∶10 mL的比例进行冰浴匀浆。4 ℃、8 000 r/min离心10 min，取上清液置于冰上，并采用分光光度计在波长470 nm下测定吸光度[15]，POD活性单位为U/g。

1.3.2 SOD活性测定 使用超氧化物歧化酶试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司），匀浆操作同“13.1”节，取上清液置于冰上，并采用分光光度计在波长450 nm下测定吸光度[15]，SOD活性单位为U/g。

1.3.3 APX活性测定 使用抗坏血酸过氧化物酶试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司），匀浆操作同“1.3.1”节，4 ℃、13 000 r/min离心20 min，取上清液置于冰上，并采用分光光度计在波长290 nm下测定吸光度[15]，APX活性单位为μmol/（min·g）。

1.4 数据统计与分析

本试验数据采用Excel 2016进行作图，采用SPSS 21.0软件进行相关统计分析，并采用邓肯氏新复极差多重比较法对试验结果进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 二氯喹啉酸和莠去津对烟草幼苗根长的影响

如表1所示，不同浓度二氯喹啉酸和莠去津对烟草幼苗根系生长具有重要影响。二氯喹啉酸各处理的烟苗根长随培养时间而整体逐渐增加，但增加幅度随着处理浓度的增加而减小。各取样时段的烟苗根长与CK相比显著降低（ P <005）。由图1可知，二氯喹啉酸和莠去津各处理的根长增长量与CK相比存在显著差异（ P <005），并且同一浓度的处理均随着培养时间的增长，其根长增长量整体呈降低趋势。

莠去津处理组根长增长量变化规律与二氯喹啉酸处理组相似， 也呈现出各处理的烟苗根长随培养时间而逐渐增加，但增加幅度随着处理浓度的增加而减小，随着除草剂胁迫浓度及天数的增加，莠去津各处理对烟苗根长和根长增长量影响越大。可见，二氯喹啉酸和莠去津对烟苗根长发育的影响具有明显的剂量和时间效应。

2.2 二氯喹啉酸和莠去津对烟草幼苗POD活性的影响

POD能够清除植株体内的羟自由基，并与生长素调节等功能有关[16]。由图2可知，POD活性均随除草剂二氯喹啉酸和莠去津浓度的增加而升高。二氯喹啉酸处理中，烟苗POD活性随培养时间整体呈波动变化趋势，且随处理浓度的增加而增加。试验期间二氯喹啉酸C 1处理POD活性均高于CK，且在第5、第19天取样的酶活性与CK相比具有显著差异（ P <0.05）;与CK相比，C 4处理烟苗POD活性分别高出330.97%、137.90%、202.75%、14135%、174.36%。除胁迫后第5天外，其余取样时段二氯喹啉酸C 2、C 3和C 4处理间差异均不显著。

莠去津胁迫处理的烟苗POD活性与二氯喹啉酸处理基本一致，5次取样的莠去津Y 4处理与CK相比，其烟苗POD活性分别高出259.29%、12661%、143.41%、175.96%、132.05%，除胁迫后第5、第24天时段外，其余时段莠去津Y 1处理均与CK差异不显著;此外除胁迫后第19天外，Y 1和Y 2处理在其他取样时段均无显著差异，且除胁迫后第5天外，Y 4处理的POD活性均显著高于Y 2、Y 3处理。可见，二氯喹啉酸和莠去津各处理烟苗POD活性随胁迫浓度增加呈不同程度增加。

2.3 二氯喹啉酸和莠去津对烟草幼苗SOD活性的影响

SOD是植物体存在的一种抗氧化金属酶，作用是催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，是植物体氧化与抗氧化的平衡剂[17]。由图3可知，二氯喹啉酸和莠去津胁迫的烟苗SOD活性均随培养时间出现下降趋势;其中二氯喹啉酸C 4处理的前2次取样的SOD活性分别比CK高出158.43%、110.79%，莠去津Y 4处理的前2次取样的SOD活性分别比CK高出107.31%、136.86%。在第14、第19、第24天的3次取样中，2种除草剂胁迫下烟苗SOD活性整体下降，且不同浓度处理间及其与CK间的SOD活性差异也变小。3次取样中各浓度二氯喹啉酸处理的烟苗SOD活性分别平均比CK高出18.50%、12.04%和64.31%;莠去津各处理的烟苗SOD活性分别平均比CK高出1430%、6.24%和50.91%。可见，二氯喹啉酸和莠去津的各浓度胁迫均诱导烟苗SOD活性不同程度增加，但均随胁迫时间延长其增加幅度下降。

2.4 二氯喹啉酸和莠去津对烟草幼苗APX活性的影响

APX是植物活性氧代谢系统的重要组成环节，特别是叶绿体中清除H 2O 2的过程，更是维生素C代謝的主要酶类[18]。由图4可知，二氯喹啉酸和莠去津对烟草幼苗APX活性的胁迫作用基本一致，均诱导烟苗APX活性增强，且烟草幼苗的APX活性均随着除草剂浓度增大而增加，取样时段内2种除草剂中高浓度胁迫下烟苗APX活性均显著高于CK，且随着胁迫天数增加，各胁迫处理的烟草幼苗APX活性整体呈降低趋势。

5次取样的二氯喹啉酸C 4处理的烟苗APX活性比CK分别高出170.59%、740.00%、34444%、660.00%、210.00%，且C 4处理在第9、第14、第19天的APX活性显著高于其他处理。莠去津各处理结果与二氯喹啉酸类似，整体上各处理APX活性均随胁迫浓度增大呈增加趋势，但除第9天外，Y 3和Y 4处理的APX活性无显著差异，且5次取样中Y 4处理的烟苗APX活性比CK分别高出188.16%、11000%、201.11%、540.00%、170.00%。

3 讨论

3.1 二氯喹啉酸和莠去津对烟草生长发育的影响

在烟草的生长过程中施用二氯喹啉酸会产生抑制作用[19]，并对烤后烟上等烟产量比例造成严重影響，土壤中二氯喹啉酸导致烟草药害产生的残留阈值为0.006 mg/kg，超过其残留阈值新叶会出现畸形，叶面皱缩，叶缘锯齿状，向背面卷曲，叶尖向下勾等药害现象[20-21]。王诚浩等在郴州烟稻轮作区水稻种植期，施用了浓度为1 500 g/hm2的50%二氯喹啉酸可湿性粉剂，发现后茬烤烟出现中度药害[22]，而其烤烟种子在经过二氯喹啉酸处理后，对其发芽情况和种子活力指数均有明显影响[23]，受药害烟株叶片细胞内叶片蒸腾速度、叶绿素含量、净光合速率、气孔导度和气孔限制值下降，胞间CO 2浓度升高[24]。本研究发现，二氯喹啉酸通过水培液从根部吸收进入烟草幼苗体内后，活性氧大量积累，影响了根系的生长，并且对根系生长的抑制作用随着二氯喹啉酸浓度的升高而增大，这与Yang等的研究结果[25]一致。

莠去津通过影响抑制植物光合作用，如结合在质体醌的位置，当莠去津结合质体醌后，质体醌分子不能再结合和传递电子[26]，这些没有被结合和传递的电子就会与细胞膜中的油脂反应，破坏细胞膜，导致细胞死亡，进而影响植物生长[27]。土壤中莠去津导致烟草药害产生的残留阈值暂不明确。王容燕等在甘薯种植试验中发现，随着莠去津浓度的增加，对甘薯根部的抑制作用逐渐增加，在 1 μg/kg 处理中甘薯根系鲜质量与对照相比有所减轻，但二者之间差异不显著，2 μg/kg处理的根系呈现出明显的药害症状;4 μg/kg处理的根系鲜质量与空白对照相比下降了49.57%，两者之间差异显著[28]。王曌研究发现，花生在0.1 mg/kg莠去津处理下出苗正常，但在出苗后7 d内底部叶片逐渐失绿黄化至枯萎;而黄瓜在0.1 mg/kg浓度时即出现药害，新叶变色，白化枯萎，最后停止生长死亡[29]。本研究发现，莠去津通过水培液吸收进入烟草幼苗体内后，抑制了其光合作用，进而影响幼苗根部生长发育，并且对根系生长的抑制作用随莠去津浓度升高而增大，这与Wang等的研究结果[30]一致。

3.2 二氯喹啉酸和莠去津对烟草幼苗POD、SOD和APX活性的影响

POD、SOD和APX是植物活性氧清除系统的重要组成部分，为烟草防御系统提供了重要支持[16-18]，在遭受除草剂特别是激素类胁迫时起着重要作用[15]。

在二氯喹啉酸长时间的胁迫条件下，能诱导激活烟草保护酶的活性，保护酶具有清除自由基毒害的功能，在一定范围内减轻氧自由基给机体造成的损伤，维持烟草生活的状态[15]。李晶新的研究显示，POD和APX活性随着二氯喹啉酸浓度增加而增加，SOD活性随着二氯喹啉酸浓度的升高而降低[31]，本试验的结论与之一致，主要原因可能是水培液中二氯喹啉酸浓度与胁迫时间不够导致的，POD与APX在其应激范围内对植物生理活动进行调节，而SOD活性下降，这与刘华山等的研究结论[32]一致，这可能是SOD由于胁迫作用超过了烟草幼苗自身的应激限度而导致其活性下降所致。此外，本研究发现，随着除草剂浓度升高，POD 活性提高，二氯喹啉酸胁迫组的烟草幼苗POD活性均在第14天达到了峰值，在第14天后各浓度处理组POD活性均有一定程度的降低，表明二氯喹啉酸长时间胁迫可能使得烟草幼苗的POD活性降低，这与Sunohara 等的研究结论[33]一致。

莠去津的胁迫同样能诱导激活烟草保护酶的活性，Shahid等研究发现，在皇竹草的水培胁迫试验中，莠去津胁迫5 d后POD活性显著高于对照，而随着胁迫时间的增长，各处理组的POD活性又有一定程度的降低，而SOD活性随着莠去津浓度的升高而降低[34]，这可能是除草剂长时间胁迫作用超过了烟草幼苗自身的应激限度，从而导致了SOD活性下降[35-36]。

研究表明，二氯喹啉酸和莠去津的化学胁迫使得烟草幼苗中活性氧清除系统（POD、APX）活性提高[31]，这与本研究中不同浓度的二氯喹啉酸和莠去津对烟草幼苗保护酶活性影响结果相似。二氯喹啉酸和莠去津的化学胁迫可以对烟草幼苗保护酶活性造成影响，在一定范围内减轻由此产生的氧自由基给机体造成的损伤，但是高度胁迫下植物保护酶（POD、SOD、APX）的活性虽然明显变化，但植物体内仍积累了大量活性氧，提示酶清除活性氧自由基的作用滞后于活性氧自由基对膜脂过氧化的诱导，对烟草幼苗的生长仍有负面的影响[37]。

二氯喹啉酸和莠去津是烟田中主要残留的除草剂，对烟草生长发育及酶系统具有重要负面影响。本试验结果主要是在水培条件下得出，可能与田间试验的结果具有一定差异，后续将开展田间验证试验，进一步开展2种除草剂对烟草生长发育及酶活性系统的影响及内在机制探究。

4 结论

本研究表明，在水培试验条件下，不同浓度的二氯喹啉酸和莠去津均影响烟苗的根系生长，根长及根长增长量随胁迫浓度及培养时间而降低，这表明二氯喹啉酸和莠去津对烟苗根长发育的影响具有明显的剂量和时间效应。二氯喹啉酸和莠去津各处理烟苗POD活性随胁迫浓度增加呈不同程度增加，二氯喹啉酸和莠去津的各浓度胁迫均可诱导烟苗SOD及APX活性增加，且2种酶活性均随除草剂浓度增大而增强，均随培养时间呈降低趋势，显示出2种不同浓度的除草剂均能诱导激活烟草保护酶活性，但随作用时间延长其酶活性下降。此外本研究是基于水培试验的结果，关于除草剂胁迫对烟草根系发育及保护酶活性的影响及机制，还需田间试验验证及其分子层面的系统研究与机制解析。

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