扶正化瘀方制剂抗肝纤维化的国际化与现代化研究进展

文 刘成海 孙鑫 赵志敏（上海中医药大学肝病研究所，上海市中医临床重点实验室）

由中药复方形成的中成药制剂，虽然其组方与应用受到中医理论指导，但做为一种天然药物，有着化学药物相似的要求：产品制剂的稳定可靠性、临床疗效的可重复性、临床使用的安全性、以及作用原理的可明性。这些国际上的通行认识与要求，也是中药现代化发展的重要目标与内容，因此中医药的国际化与现代化常常互为一体，相互促进。近10余年来，围绕扶正化瘀方制剂（片剂或胶囊）的美国注册临床试验，我们与国内外同行进行了相关临床与基础工作，部分进展如下。

一、美国多中心临床试验提示扶正化瘀片对慢性丙肝显著肝纤维化患者有良好作用

肝纤维化是肝脏对慢性损伤的一种修复反应，以肝组织内细胞外基质(ECM) 成分的过度增生与异常沉积为特征，可导致肝硬化及其门脉高压，逆转或减轻肝纤维化是慢性肝病的重要治疗措施。肝纤维化病理机制复杂，涉及肝实质细胞损伤、肝星状细胞(HSC)增殖活化、肝窦内皮细胞去分化、肝巨噬细胞表型变化等多个环节多个途径病理变化，因而基于单一靶点的生物或化学药物目前尚未取得明显进展，现代医学的抗肝纤维化进展主要在于抗病毒等病因治疗，因此国内外对抗肝纤维化一直有重大需求。2002年扶正化瘀方制剂（片剂或胶囊）国内上市后，在乙肝相关肝纤维化患者广泛应用，促进了患者的康复。对于其他病因的肝纤维化有无作用？基于这个问题，我们与美国肝病专家联合开展了相关临床研究。

2013年，扶正化瘀片完成抗慢性丙型肝炎肝纤维化美国FDA注册II期临床试验，同年11月在美国肝病年会卫星会上报告研究结果（图1）。该研究是在贝勒医学院、斯坦福大学、加州大学戴维斯分校等多中心开展的随机双盲安慰剂对照观察，主要以治疗前后肝组织活检的纤维化程度改变为疗效评价指标，该研究主要负责人、加利福尼亚大学圣地亚哥分校Hassanein教授表示，研究验证了扶正化瘀片治疗慢性丙型肝炎肝纤维化的安全性、耐受性及有效性，扶正化瘀片显示出具有阻止肝纤维化的良好趋势，并构建了中西医肝病交流的桥梁。

图1.2013年11月扶正化瘀片在美国肝病年会期间召开卫星会

其后，研究者又对治疗前后两次肝活检样本做了二次谐波震荡/ 双光子激发荧光（SHG/TPEF）显微镜成像分析，通过定量肝纤维化（qFibrosis）的方法计算评估肝纤维化程度。整个过程操作者采用盲法评判，并分别将汇管区（Zone1,1区）、中央静脉区（Zone3,3区）和中间区（Zone2,2区）等3个不同分区的纤维化进行分析，结果显示：与安慰剂组相比，扶正化瘀片对基线时Ishak纤维化分期为F3和F4的丙肝肝纤维化患者有良好的消退效果，并且qFibrosis分析证实：与安慰剂组相比，扶正化瘀片组患者肝组织病理3个区域的纤维化程度均显著改善。

二、扶正化瘀方的多途径作用机制与活性成分被不断揭示，促进对中药复杂综合作用机制的认识与中药成分新复方的发展

扶正化瘀方抗肝纤维化药理复杂，包括：1.通过调节死亡受体介质和线粒体通路抑制肝细胞凋亡，抗氧化应减轻肝细胞炎性坏死等。（2）通过调节转化生长因子β1（TGF-β1）/Smads、PDGFBB/MAPK、及FN/整合素等信号通路，扶正化瘀方抑制肝星状细胞活化。HSC是肝纤维化的细胞学基础，受到肝细胞损伤与巨噬细胞等分泌的促炎性与促纤维化因子如氧化自由基、TGF-β1等的刺激，而发生活化，生成细胞外基质。我们实验室、香港大学、美国加州大学圣迭戈分校[6-8]等均发现相似结果：扶正化瘀方可抑制体内模型大鼠肝组织与体外TGF-β1诱导的HSC活化，其作用机制与调控TGFβ/Smad、PDGF-BB/MAPK、及FN/整合素等信号转导有关。

新近我们与美国斯坦福大学合作研究发现：扶正化瘀方通过调节HIF-1α/VEGF/ERK通路改善肝窦内皮细胞损伤和抑制肝血管新生。肝窦内皮损伤后，促血管新生信号分子（如VEGF/PDGF等）表达增加，不仅促进HSC活化，也促进肝脏血管新生，导致肝窦毛细血管化，构成肝纤维化与门脉高压的重要病理基础。扶正化瘀方改善肝窦毛细血管化，减轻门脉压力，其机制除了抑制HSC活化、减少TIMP1表达与促进间质性胶原酶活性外，与下调HIF-1α、VEGF/MAPK信号通路，抑制肝窦内皮细胞去分化及其肝血管新生密切有关。

我们近年提出“肝纤维化免疫微环境”概念[10]，其有肝内NK细胞、巨噬细胞、肝星状细胞、肝窦内皮细胞等构成，其中免疫细胞对于启动与维持肝纤维化有重要作用。而扶正化瘀方调节肝脏巨噬细胞CCL2/CX3CL1轴、促进其从M1向M2型极化，并影响肝脏巨噬细胞的募集而抗肝纤维化。

既往我们在肝纤维化患者与实验动物中，发现扶正化瘀方有32种明显入血成分，包括丹参酮IIA、丹酚酸B、五味子醇甲、苦杏仁苷、商陆素、松花粉、大豆苷元等。随后采用细胞高内涵筛选评价等技术，以肝星状细胞、肝细胞、内皮细胞等细胞模型，HL-7702，发现9种成分具有较强的抗纤维化活性：丹酚酸B、迷迭香酸、咖啡酸、原儿茶醛、丹参素钠，虫草腺苷、五味子丙素等，以3种成分作用最为显著。而后根据这些成分的活性作用与体内过程等特点，经过多次实验，形成以7种成分组成扶正化瘀成分新复方，动物实验证实对肝纤维化有良好作用。这不仅说明扶正化瘀方确实存在活性成分，且也证实了我们此前基于肝细胞、肝星状细胞与内皮细胞等对扶正化瘀方的机制认识是正确的，并为新一代的抗肝纤维化中药研发提供了参考。

三、中药化学成分测定与全方生物活性测定相结合，促进扶正化瘀方制剂产品的质量可控性

经过多年努力，扶正化瘀方制剂（胶囊/片剂）已经建立从源头（栽培种植、形状鉴别等）、过程（生产工艺等）、到指标控制（成分检测等）的较为完备的质量控制体系，在这三大质控环节中，分别形成GAP药材栽培种植、药材外观形状鉴别、化学定性鉴别、指标成分检测、化学指纹图谱等方法，来保证不同批次中药的一致性。这些质控方法与标准完全满足国家药品管理相关要求，基本保证了产品质量。尤其是指纹图谱分析，克服了单一成分检测缺点，可整体性反映物质群，符合中药多组分与多靶点特点，是目前中药质量评价的重要方法。

但是，在我们完成扶正化瘀片抗肝纤维化的II期临床试验，准备开展III期临床试验时遇到新挑战：美国FDA明确要求扶正化瘀片需建立生物活性的质量控制标准，以保证不同批次间产品的稳定性。基于化学基准的质量控制常用于化学药物等，但对于中药存在一定局限性，会出现中药复方检出成分与功效之间关联性差的情况，究其主要原因在于：（1）中药成分组成复杂，种类繁多，中药复方更是加重了这种复杂性，目前无法检测到中药全部成分并进行质量控制。（2）中药成分并非一成不变。受植物产地、生长时间、季节、加工、炮制等多种因素，可导致中药成分组成变化。（3）所测成分并非有效成分，缺乏专属性与代表性。选择含量高、反应快、容易检出的成分进行检测，虽然这些成分是中药的固有物质，但不一定是复方所针对适应症的活性成分。临床疗效是中药物质成分群的最终反映与价值所在，而生物活性则是疗效实现的前提与基础。因此中药的质量控制，除了化学成分检测，尚需要结合生物活性评价。

关键靶标分子控制细胞信号转导，影响或决定药物疗效，中药具有调节细胞信号转导的多途径作用机制，一定的药物靶标群活性可反映中药复方的特定疗效，作为其生物活性质量评价的新方法。因此，我们通过网络药理学并结合细胞分子药理等方法，首先明确扶正化瘀方抗肝纤维化的关键作用靶标，针对该靶标群，构建荧光素酶报道基因与融合蛋白的稳转细胞株，建立药物靶标群的基因转录与蛋白活性测定平台。通过检测扶正化瘀方抗肝纤维化的主要药物靶标的生物活性，以评价中药复方的药效作用与产品质量。将该中药复方指标质控方法从既往以植物成分为主，改变为复方生物活性+中药活性成分相结合，从“就药论药”到“医药结合”，既可满足FDA的III期临床试验要求，也可促进中药复方关键作用制剂的进一步明确。目前，我们以建立扶正化瘀浸膏粉的标准体外给药方法，确定NF-κB与Smad3等扶正化瘀方抗肝纤维化主要靶标，进行慢病毒包装并感染293T细胞，抗性筛选后获得稳定表达NF-κB-luc2和Smad3-luc2等的细胞株，建立了相关荧光素酶报告基因稳转细胞株，以评价复方的抗肝纤维化活性作用。