鸦胆子对非小细胞肺癌细胞增殖的影响及机制

徐文静，李振汉，李子林，吴志浩,4

(皖南医学院 1.肿瘤微环境研究室；2.临床医学院；3.影像学院；4.医学生物学教研室，安徽 芜湖 241002)

肺癌发病进展迅速、频繁复发、预后差、病死率高。目前治疗手段主要包括放射治疗、药物治疗和免疫治疗等[1]，而化疗药物的广泛应用，除了引起部分患者皮疹、腹泻、呕吐、肝功能障碍和细胞免疫缺陷外，越来越多患者表现出获得性耐药[2]。天然药物因其复杂的元素结构和丰富的生物活性，逐渐成为开发成抗癌药物的基础[3]，化疗药物与天然药物联用能发挥协同作用或叠加效应，获得更好的治疗效果[4]。近年来，天然药物的使用量一直在增加[5]，其中鸦胆子已被证实在癌症的治疗过程中起着重要的作用[6]。本研究旨在阐明鸦胆子对非小细胞肺癌的影响和分子机制，有助于对鸦胆子有效活性成分的开发利用，为天然药辅助肺癌及其他类型癌症临床治疗开拓新思路。

1 材料与方法

1.1 网络药理学分析

1.1.1 鸦胆子活性成分的收集及其成分作用靶点预测 通过检索中药系统药理学数据库(TCMSP，https://tcmspw.com/)鸦胆子活性成分，获得其分子编号、生物利用度(oral bioavailability，OB)、类药性(drug-likeness，DL)等。利用GenneCards(https://www.genecards.org/)数据库将药物活性成分靶点的蛋白名称转换成基因名称。

1.1.2 非小细胞肺癌疾病相关靶点收集 利用GeneCards数据库检索关键字“NSCLC”，筛选获得疾病靶点。利用在线韦恩分析工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/)获取治疗肺癌的共同靶点。

1.1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络构建 将筛选得到的相关靶点信息导入STRING在线分析平台(https://string-db.org/)，物种限定为“homo sapiens”，获取PPI信息，分析网络拓扑参数，获得PPI网络图，再利用Cytoscape软件对该网络模型做拓扑分析。

1.2 体外实验验证

1.2.1 细胞株、主要试剂及仪器 人非小细胞肺癌细胞系A549、PC-9、H1299(中国科学院细胞库所赠予)。鸦胆子油乳(Brucea javanica oil emulsion，BJOE)购自延安制药股份有限公司(国药准字：Z61020267)、顺铂购自江苏豪森要业股份有限公司(国药准字：H20040813)、DMEM培养基(GIBCO)、小牛血清(GIBCO)、青链霉素(Hyclon)、细胞培养箱(Eppendorf)、低温水平摇床(New Brunswick)、化学发光显影成像系统(GE)、BioTek酶标仪(伯腾公司)、细胞周期检测试剂盒(凯基)、细胞凋亡检测试剂盒(碧云天)、流式细胞仪(BD)、β-actin抗体(Sigma)、P21抗体(ABclonal)、P53抗体(CST)、兔抗(CST)、鼠抗(CST)。

1.2.2 细胞培养 置于37℃、5%CO2的培养箱中，以10%FBS的DMEM培养基培养，于对数期用胰酶消化处理用于实验。

1.2.3 质粒转染 细胞密度生长至80%，换液后加入的培养基于培养箱中静置30 min，实验组和对照组分别加入空载体质粒、P53质粒以及Polyjet转染试剂转染细胞，培养48 h(转染后6 h需换液)。

1.2.4 噻唑蓝(MTT)细胞活力检测实验 加入0、2、4、6、8、10 μg/μL的BJOE处理96孔板中的细胞12 h。两板中均加入新配的0.5 mg/mL MTT溶液200 μL/孔，处理3 h后弃上清，加入二甲基亚砜150 μL/孔，摇床避光震荡15 min。酶标仪测定570 nm处吸光度。利用Graphpad Prism软件处理数据。

1.2.5 流式细胞术测细胞周期 加入6 μg/μL BJOE处理细胞12 h后，细胞密度调至1×106/mL，加入冷的70%乙醇4℃固定过夜，去除固定液，加入PI/RNaseA染液500 μL，室温避光静置60 min，利用流式细胞仪检测细胞凋亡，数据用FlowJO软件分析。

1.2.6 AnnexinV-FITC/PI(propidium iodide)双染法测细胞凋亡 按BJOE 6 μg/μL、顺铂20 μg/μL处理六孔板中细胞，加入无EDTA胰酶消化收集细胞至收集管中，细胞密度调至1×105/mL，离心去上清，加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞，先后加入5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI染液混匀，室温避光孵育15 min，利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 基于网络药理学探讨鸦胆子治疗非小细胞肺癌的作用机制

2.1.1 鸦胆子主要活性成分及其参数 利用TCMSP数据库检索得到鸦胆子有效活性成分67个，根据OB≥30%和DL≥0.18筛选得到15种生物利用度、药物相似性较好的活性成分(见表1)。

2.1.2 PPI网络构建及作用靶点分析 通过TCMSP数据库筛选得到鸦胆子活性成分靶点86个和GeneCards数据库得到非小细胞肺癌靶点4 384个，韦恩在线分析平台获得鸦胆子治疗非小细胞肺癌的潜在靶点70个。利用String在线平台对这70个基因进行PPI网络分析(图1)，设置物种为人源，PPI评分致信度为0.9，隐藏离散的靶点。该图涉及103个节点及295条边，平均节点5.73。根据PPI网络拓扑属性分析，选取“度中心性”(degree)及“介度中心性”(betweenness)均大于均值的点作为关键靶点，平均度值为6.52，平均介度中心性为2.30×10-2，得到14个鸦胆子治疗非小细胞肺癌潜在靶点(见表2)。

表1 鸦胆子有效活性成分

2.2 非小细胞肺癌体外实验验证

2.2.1 BJOE抑制A549、PC-9细胞增殖 应用不同浓度BJOE 0、2、4、6、8、10 μg/μL 处理细胞，结果显示：A549、PC-9细胞增殖能力随着BJOE浓度升高而下降(FA549=188.979，FPC-9=105.527，P<0.001)，但对人支气管上皮细胞HBE增殖能力并无影响，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 鸦胆子对细胞增殖能力的影响(浓度依赖性)(n=4)

2.2.2 BJOE抑制非小细胞肺癌细胞周期 细胞周期检测结果显示，与对照组相比，实验组A549、PC-9细胞在6 μg/μL BJOE处理下，G0/G1期细胞占比升高，S期占比下降，G2期A549细胞中占比上升、PC-9细胞中占比下降，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示BJOE主要使细胞周期阻滞在G0/G1期，从而抑制细胞周期的进程，见图2和表4。

图2 BJOE抑制A549、PC-9细胞周期

2.2.3 BJOE可通过P53参与调控细胞周期 Western blot结果显示，非小细胞肺癌A549、PC-9细胞内P21蛋白表达水平均上调，而H1299细胞P21蛋白表达水平下调(图3A、B、C)。在P53缺失型的H1299细胞中过表达P53cDNA发现，与对照组相比，P21水平明显升高(图3C)。

2.2.4 BJOE对化疗药物的增敏作用 MTT和凋亡实验结果表明，与空白对照组相比，BJOE(6 μg/μL)和DDP(20 μmol/L)均能抑制细胞增殖、促进细胞凋亡，差异有统计学意义(P<0.05)；与单独用药相比，药物联合处理对细胞增殖和促进凋亡的作用更为明显，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4和表5。

表4 BJOE抑制A549、PC-9细胞周期量化表(n=3)

图3 BJOE通过P53调控细胞周期

图4 BJOE与顺铂单独和联用处理对细胞凋亡的影响

表5 BJOE和顺铂单独与联用处理对细胞增殖和凋亡情况的影响(n=3)

3 讨论

近几年大多数癌症的生存率都在稳步上升，而肺癌的5年生存率仍处于停滞状态[7]。75%以上的患者初诊时已处于肺癌晚期，容易错失手术治疗的机会[8]。目前非小细胞肺癌主要治疗方案均是以铂类药物为基础的药物联合使用，其抗肿瘤疗效已得到证实[9]。但是当肿瘤复发时，往往会产生耐药性，导致肺癌后续治疗更加复杂和困难。天然药物在某种程度上能够改善铂类药物耐药性的发生，如鸦胆子有助于提高肺癌治疗效果。

在本研究中，首先通过网络药理学对鸦胆子的成分进行了筛选出鸦胆子活性成分15个，发现鸦胆子主要活性成分有β-谷甾醇、毛地黄黄酮、鸦胆子苷M、鸦胆子苷L、鸦胆子苷P、鸦胆子苷D、鸦胆子苷B、鸦胆子苦醇等，这些活性成分的口服生物利用度、类药性均良好，提示鸦胆子有效成分的开发利用对于肿瘤治疗具有积极的临床意义。这些活性成分作用靶点收集结果得到鸦胆子治疗非小细胞肺癌潜在靶点70个，进一步筛选得到前14个靶点，包括TP53、AKT1、MAPK1、JUN、RELA、TNF、CASP3、APP、CCND1、CDKN1A、EGFR、CCNB1等，TP53基因编码的P53蛋白排首位，提示BJOE治疗非小细胞肺癌分子机制很有可能与该靶点密切相关。

在体外验证实验中，首先发现BJOE能够抑制非小细胞肺癌细胞的增殖活性，并且具有剂量依赖性。有趣的是，在A549和PC-9细胞中细胞周期负性调控因子P21表达量随着BJOE剂量增加而增加，而在H1299细胞中表达量却降低，结合之前的网络药理学的靶点预测结果和H1299细胞遗传背景(P53缺失突变)，考虑这一相反的结果是否与P53蛋白表达有关，经实验验证，BJOE的确能通过调控P53蛋白来控制P21蛋白的表达，流式检测周期结果为BJOE将细胞周期主要阻滞在G0/G1期。这可能与已知的经典P53依赖途径[10-11]相关，即BJOE可能造成DNA损伤，P53被激活，与P21启动子结合后激活P21蛋白的表达，后者再通过与CDK4、CDK6/cyclin D或CDK2/cyclin E结合，从而抑制细胞周期蛋白依赖激酶活性，使得细胞周期阻滞，抑制细胞增殖。接下来，考虑到化疗药物顺铂耐药性的产生对非小细胞肺癌治疗效果的影响，通过网络药理学分析发现非小细胞肺癌对铂类药物的耐药性可能存在作用靶点，通过MTT实验发现，BJOE与顺铂的联合用药比单独用药能够更显著抑制细胞增殖活力和促进细胞凋亡。该实验结果提示，BJOE对于化疗药物顺铂具有增敏作用，该增敏作用机制有待于进一步探究。

综上所述，综合网络药理学和体外实验结果均表明，BJOE对于治疗非小细胞肺癌具有很好的应用前景，其活性成分的开发和利用具有积极的临床意义。其能够抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，提高顺铂的治疗效果。但临床上尚需进一步明确鸦胆子发挥作用的具体活性成分及其机制。