4-PBA治疗单侧肾输尿管结扎小鼠肾脏纤维化的机制探讨

余 剑，陈 曦，方 洁，徐爱萍，邵德翠

(皖南医学院 细胞电生理研究室，安徽 芜湖 241002)

慢性肾脏疾病(chronic kidney disease，CKD)已成为全球性公共卫生问题，各种危险因素如高血糖、高尿酸、肥胖等都可导致CKD，其发病率逐年增加。肾脏纤维化是CKD的特征之一，以细胞外基质的过度沉积和大量肌纤维母细胞的浸润为其主要特征[1]。对肾纤维化的机制认知尚不完全，仍缺乏非常有效、特异的治疗手段。

近年来，内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)成为关注的新热点，内质网(endoplasmic reticulum，ER)是细胞内除核酸以外的生物大分子合成的场所。正常生理情况下，ER具有强大的维持细胞内环境稳态的功能，当某种诱因(如葡萄糖或营养物质的缺乏、脂质过度负荷、Ca2+代谢失衡、氧化应激与缺血再灌注等)打破了这种稳态，使细胞内蛋白质合成速度过快，超过了ER折叠能力，导致ER处于一种生理功能紊乱状态，即形成ERS[2]。ERS与急性肾损伤向CKD的转变密切相关[3-4]。4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)是化学合成的小分子伴侣，可以减轻ERS[5]。故我们研究目的在于探讨4-PBA治疗是否可以缓解UUO所致的肾脏纤维化，并在培养的肾小管上皮细胞探讨其改善肾脏纤维化的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性C57BL/6J小鼠(20～25 g)购自南京青龙山。动物合格证号：SCXK(豫)2019-0002。

1.1.2 药物及主要试剂 DMEM低糖培养基(Cat#8120459，Gbico)和新生牛血清(Gbico)；100×的青霉素和链霉素溶液(Cat#BL008A，BIOMIKY)、ECL化学发光试剂(Beyotime Biotechnology)、BCA蛋白测定试剂(Beyotime Biotechnology)；4-PBA(Sigma)；一抗：Fibronectin、Collagen Ⅳ、GRP78和p47phox抗体购自abcam公司；二抗：HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)(Cat#A0208)、HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(Cat#A0216)购自Beyotime Biotechnology。

1.1.3 主要仪器 EPOCH全波长酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)、多样品组织研磨机(上海净信Tissuelyser-32)、垂直电泳仪(伯乐)、凝胶成像分析仪器(GE，AI600)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物与分组 20～25 g的雄性C57BL/6J小鼠进行单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)手术后随机分为2组：UUO模型组，UUO+4-PBA组。

1.2.2 UUO模型制备与用药 参考文献[6]进行UUO手术。C57BL/6J小鼠麻醉后取仰卧位固定于手术台上，腹部脱毛、消毒、铺巾，腹正中直切口约2 cm，分离筋膜及肌肉，暴露出左侧肾脏和输尿管，在肾盂输尿管连接处游离输尿管，以3-0丝线在左肾下极结扎两道，确认无出血后逐层缝合并关闭腹腔。麻醉苏醒后常规喂食、水。手术后第2日开始灌胃给药，每日给予4-PBA(300 mg/kg)灌胃，UUO组给予等体积的生理盐水灌胃，共14 d。

1.2.3 细胞培养 肾小管上皮细胞(NRK-52E)用10%新生牛血清的含青霉素和链霉素的DMEM低糖培养基置于37℃、5%CO2培养箱中。

1.2.4 Western blot 如前所述进行Western blot[7]，肾皮质研磨后，将组织匀浆于4℃、5 000 r/min离心10 min取上清，测定样品蛋白浓度。样品与(5×)缓冲液4∶1混合，煮沸5 min，放置-80℃冰箱保存备用。等量蛋白质上样，用7.5%～10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。吸附了蛋白的PVDF膜用5%的牛奶(TBST溶解)在室温下封闭1 h，然后放入相应的一抗中，4℃孵育过夜。用TBST洗膜后，室温下二抗孵育2 h，洗膜。避光显色，曝光。以Actin或GAPDH为内参照，Image J软件进行光密度值定量分析。

2 结果

2.1 4-PBA减轻UUO小鼠肾脏纤维化和ERS 天狼星红染色法观察梗阻侧肾脏胶原沉积变化的结果显示，相较于UUO组，4-PBA治疗改善梗阻侧肾组织的红色胶原沉积(图1)。

A.200×；B.400×。

Western blot显示，相较于UUO组，4-PBA降低了梗阻侧肾皮质的Fibronectin和Collagen Ⅳ蛋白表达水平(P<0.05)(图2)；4-PBA灌胃14 d降低了梗阻侧肾皮质的ERS标志蛋白GRP78的表达量(P<0.05)(图3)。

2.2 4-PBA减轻TGF-β诱导的NRK-52E细胞外基质合成、ERS和氧化应激 用5 ng/mL和10 ng/mL的TGF-β处理NRK-52E细胞48 h，Western blot分析显示：相较于对照组(0 ng/mL)，10 ng/mL的TGF-β明显增加NRK-52E中GRP78和Fibronectin的蛋白表达水平(P<0.05)(图4)。

n=3，t=-2.996，P=0.040；与UUO组比较，*P<0.05。

分别用5 ng/mL、10 ng/mL TGF-β处理NRK-52E细胞48 h；Western blot观察与分析不同剂量的TGF-β对Fibronectin和GRP78蛋白表达量的影响；n=3，F1=9.210，P1=0.015；n=5，F2=6.580，P2=0.012；与0 ng/mL比较，*P<0.05。

Western blot显示，4-PBA(2 mmol/L)降低TGF-β(10 ng/mL)诱导的GRP78、Fibronectin和Collagen Ⅳ的蛋白表达水平(P<0.05)(图5)。

10 ng/mL TGF-β、4-PBA(2 mmol/L)处理NRK-52E细胞48h；Western blot显示4-PBA对TGF-β诱导的Fibronectin、Collagen Ⅳ和GRP78蛋白表达量的影响；n=3，t1=4.173，t2=4.509，t3=4.199，P1=0.014，P2=0.011，P3=0.014；与对照组比较，*P<0.05。

4-PBA处理NRK-52E 48 h，Western blot显示，4-PBA(2 mmol/L)降低了TGF-β(10 ng/mL)诱导的p47phox蛋白表达量(P<0.05)(图6)。

10 ng/mL TGF-β、4-PBA(2 mmol/L)处理NRK-52E细胞48h；Western blot观察与分析4-PBA对TGF-β诱导的p47phox蛋白表达量的影响；n=4，Z=2.309，P=0.021；与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

近年来，针对肾脏纤维化的治疗有抗TGF-β靶向治疗、肾素血管紧张素系统的药物研发，但其临床疗效仍难以获得满意的治疗效果，积极有效地针对靶点选择仍被视为防止肾纤维化的重要策略[8]。ERS在肾损伤中的作用已成为近年来的热门话题，UUO小鼠肾纤维化模型上，ERS导致小鼠肾细胞凋亡和随后的纤维化，使用血管紧张素受体拮抗可明显改善纤维化，其减轻肾纤维化与调控ERS信号通路有关，提示ERS可能参与了肾纤维化的发病机制[9]，减轻ERS有望成为预防肾纤维化的一个潜在靶点[10]。

4-PBA作为一种低分子量的化学伴侣，可以防止错误折叠的蛋白质聚集并减轻ERS。近年来，其在防治肾纤维化中的作用逐渐得到学者的关注，有研究表明4-PBA减弱UUO大鼠的肾纤维化，并且4-PBA在体内外肾纤维化模型中显著减弱了GRP78蛋白的表达[11]。这与我们在UUO小鼠肾纤维化模型的研究结果一致，提示4-PBA可能通过减轻ERS而延缓肾纤维化的进展。

ERS参与肾损伤的机制可能与氧化应激有关，ROS积累可上调细胞凋亡硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)的表达，刺激磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)通路、p38MAPK信号通路与核细胞凋亡、转录因子(NF-κB)信号通路，这些信号通路在CKD的发病机制中起着至关重要作用[12]。肾脏ROS的产生主要由多种NADPH氧化酶(NOX)介导[13]。NOX包括NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5和双氧化酶Duox(Duox1和Duox2)。NOX4是目前与肾纤维化最为密切、研究最为广泛的NOX亚型，沉默NOX4可显著抑制TGF-β诱导的NOX活性刺激，抑制TGF-β受体[14]。p47phox和p67phox是NOX2的经典调节亚单位。本研究中，4-PBA可显著降低TGF-β诱导的NRK-52E的ROS生成和p47phox蛋白的表达，提示除NOX4外，NOX2可能参与肾纤维化，4-PBA可以通过NOX2减少ROS的产生。

虽然本实验证实了减轻ERS可以缓解肾脏纤维化，但ERS信号通路错综复杂，ERS是由位于内质网的三种不同跨膜蛋白质介导：蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、肌醇需要酶1(IRE1)和激活转录因子6(ATF6)。正常状态下，IRE1、PERK和ATF6蛋白与内质网上的GRP78结合，呈无活性状态；ERS发生时，IRE1和PERK从GRP78上分离后，形成二聚体，发生自身磷酸化后激活未折叠蛋白反应(UPR)，而ATF6则转移至高尔基体被进一步的剪切与激活。IRE1、PERK和ATF6三条通路激活强度以及持续时间，都可以改变细胞生理或病理反应的走向，从而决定细胞的命运：死亡或生存[15-16]。后续的研究中我们将进一步探讨ERS不同通路在UUO肾纤维化的发生发展中所起的作用。

综上所述，本研究结果表明4-PBA在UUO小鼠模型和TGF-β诱导的细胞损伤中均能有效地对抗肾纤维化，其机制可能与减轻ERS和氧化应激有关，提示抑制ERS是潜在的防治肾纤维化的治疗靶点。