高效液相色谱法测定腰痛丸中蛇床子素、升麻素苷和橙皮苷的含量

2022-05-07仇其原朱干红

药学与临床研究 2022年2期

仇其原，张卓，朱干红

1 盐城市食品药品监督检验中心，盐城 224000；2 盐城市中医院，盐城 224000

腰痛丸（Ⅰ）为棕褐色至棕黑色的水蜜丸；气微香，味稍微苦，甘，辛。其由15 味中药配伍组成，方中独活、防风、防己、威灵仙、续断、制川乌、制草乌、苍术为君药，主祛风散寒除湿；干姜、肉桂以温中散寒、通络止痛，乌梢蛇、蜈蚣以祛风通络、解痉镇痛共为臣药；茯苓、陈皮以利水渗湿、健脾益胃为佐药；甘草为使药，调和诸药，并降低制川乌、制草乌的毒性。该药主治祛风散寒、通络止痛，风寒腰痛等症。

腰痛丸（Ⅰ）中，独活、防风、陈皮的有效成分分别为蛇床子素[1]、升麻素苷[2]、橙皮苷[3]。相关药理学试验表明，蛇床子素、升麻素苷和橙皮苷是腰痛丸（Ⅰ）发挥药效作用的主要的活性成分，建立这3 种有效成分（结构式见图1）的含量测定方法，对于增加腰痛丸（Ⅰ）的药效物质基础的质量研究具有积极的作用[4]。

图1 腰痛丸（Ⅰ）中独活、防风、陈皮的有效成分及结构式

中药复方制剂的成分复杂，仅凭单味药的定性方法并不能全面有效控制腰痛丸（Ⅰ）质量与疗效的一致性。本实验采用HPLC 法，以腰痛丸（Ⅰ）中独活、防风、陈皮的各有效成分蛇床子素、升麻素苷、橙皮苷作为指标性成分，建立同时测定其含量的方法，并完成方法学研究，以可靠的方法及数据依据[3]，为建立腰痛丸（Ⅰ）制剂质量的标准提供可行性方案。

1 仪器与药品、试剂

仪器：Waters2695 高效液相色谱仪、Waters2996二极管阵列紫外检测器（PAD），Empower 色谱工作站（美国Waters 公司）；XS205 DU 电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

对照品：蛇床子素（批号110822-200407）、升麻素苷（批号111522-201209）、橙皮苷（批号110721-201316，110721-201115）均购自中国食品药品检定研究院。供试品：腰痛丸（Ⅰ）（盐城市中医院制剂室，批号190115、190601、190907）。试剂：甲醇、醋酸铵溶液为化学纯；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液精密称取蛇床子素对照品15 mg，置于100 mL 量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，即得对照品溶液（1）；精密称取升麻素苷对照品15 mg，置于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，即得对照品溶液（2）；精密称取橙皮苷对照品15 mg，置于20 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，即得对照品溶液（3）。依次从对照品溶液（1）、（2）、（3）中精密吸取1、1、2 mL，置于同一20 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀，即得混合对照品溶液①。同法依次从对照品溶液（1）、（2）、（3）中精密吸取2、2、4 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀，即得混合对照品溶液②。

2.1.2 供试品溶液从3 个批次中随机称取腰痛丸（Ⅰ）适量，研细，取约5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加甲醇100 mL，称重，水浴回流2 h，放冷，称定重量，加甲醇补到原先的重量，摇匀，滤过，即得。

2.2 色谱条件

色谱柱：Waters CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.2 mol·L-1醋酸铵溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱程序为0 min 80%A，20B；30 min 35A，65B；50 min 35A，65B；检测波长：284 nm（升麻素苷、橙皮苷），324 nm（蛇床子素）；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20 μL。系统适用性要求：供试品色谱图中，升麻素苷、橙皮苷、蛇床子素与其他峰的分离度大于1.5，理论塔板数不低于8000。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验以“2.1”项下方法所得供试品溶液及混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行专属性试验。见图2。经全波长扫描图谱的对比，供试品中蛇床子素、升麻素苷和橙皮苷峰与各对照品峰均得到指认，并达到基线分离，分离度良好，符合专属性及系统适用性要求。

图2 腰痛丸（Ⅰ）专属性试验色谱图

2.3.2 线性与范围依次从对照品溶液（1）、（2）、（3）中精密移取适量制成线性溶液，其中蛇床子素的梯度浓度为3.8、7.5、15.0、22.5、30.0 μg·mL-1；升麻素苷及橙皮苷的梯度浓度均为38、75、150、225、300 μg·mL-1；通过“2.2”项下色谱条件进样，以线性溶液中各成分相应的浓度C（μg·mL-1）为横坐标，峰面积Y（mAu*s）为纵坐标，经线性回归分别得回归方程：蛇床子素Y=5.67×105C+2.22×104，r2=0.996 0；升麻素苷Y=2.00×106C+2.30×104，r2=0.998 0；橙皮苷Y=1.00×106C+1.05×105，r2=0.998 0。在相应的线性范畴内，3 成分均呈良好的线性关系。

2.3.3 进样精密度试验取“2.1”项下所配供试品溶液及混合对照品溶液适量，按“2.2”项下色谱条件连续进样6 次，分别计算各指标性成分峰面积的相对标准偏差（RSD），蛇床子素、升麻素苷、橙皮苷峰面积RSD分别为0.44%、0.94%、0.32%。表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验取同一批号的腰痛丸（Ⅰ）制备供试品溶液，于0、2、4、8、16、24 h 按“2.2”项下色谱条件进样测定，得供试品溶液中蛇床子素、升麻素苷、橙皮苷的峰面积的RSD 分别为：1.06%、0.93%、0.46%，表明供试品溶液24 h 内有良好的稳定性。

2.3.5 重复性考察取同一批号腰痛丸（Ⅰ）平行制备6 份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，按标准曲线法分别计算各指标性成分含量的RSD 值。结果蛇床子素、升麻素苷、橙皮苷的含量RSD 分别为0.91%、0.74%、0.13%，表明本方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验精密称取已知含量的腰痛丸（Ⅰ）5g，共5 份，置于具塞瓶中，精密加入蛇床子素对照品溶液（0.5 mg·mL-1）1.0 mL，升麻素苷对照品溶液（3.0 mg·mL-1）1.0 mL，橙皮苷对照品溶液（10 mg·mL-1）1.0 mL，加甲醇100 mL，称重，水浴回流2 h，放冷，称重，加甲醇补到原先的重量，摇匀，滤过，即得加样回收率试验的供试品溶液。按“2.2”项下色谱条件进样测定，并根据公式：回收率=（实测量-供试品所含被测成分量）/加入对照品量×100%，计算回收率，蛇床子素、升麻素苷、橙皮苷的加样回收率分别为98.43%、98.20%、98.50%，可以满足实验要求。