食品中香兰素检测方法研究进展

陈林林，郑凤鸣，范天娇，张佳欣，杨茜瑶

(哈尔滨商业大学 食品工程学院，哈尔滨 150028)

香兰素(vanillin, VAN)又名3-甲氧基-4-羟基苯甲醛或香草醛，分子式为 C8H8O3，外观呈白色或淡黄色结晶，通常包括甲基香兰素和乙基香兰素，最早是从兰科植物香荚兰中发现的，从而带有香荚兰香气和浓重的奶香。19世纪后，科技的进步带动了香荚兰中香兰素的提取技术发展，并将其应用于食品领域，如乳制品、糖果、橄榄油、饼干、巧克力、蛋糕等的增香剂和固香剂，是全世界产量最大的合成香料品种之一[1-2]。

然而，有研究表明摄入大量的合成香兰素会引起头痛、恶心、呕吐，甚至还会对肝和肾的功能造成影响，对人体健康造成威胁[3]。粮食及农业组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)联合专家委员会限制的香兰素每日最大摄入量为10 mg/kg，国家标准GB 2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》同样规定了香兰素在食品中的使用限量。在中国，0～6个月的婴儿配方奶粉中被禁止添加香兰素，其原因是香兰素拥有浓重的奶香气味，会导致婴幼儿对这种奶粉产生过度依赖，以此来增加此奶粉的销量。此外，婴儿肝脏和肾脏的解毒能力在这一阶段较差，食用香兰素对婴儿的肝脏和肾脏造成的伤害更是不可治愈的[4-5]。然而作为一种使用率极高的食用调味品，香兰素在婴幼儿配方奶粉中被广泛添加，其含量超标问题也一直被人们忽略。如2021年5月6日上海市场监管局在某公司生产的婴幼儿奶粉中检测出一定含量的香兰素，并对其没收物品并处罚金，这也是近3年国内对奶粉品牌开出的最大罚单。抽样人员对当事人进口总经销的某婴儿配方奶粉0～6月龄1段进行了监督抽检。经宁波海关技术中心检验，其出具的检验报告显示：上述批次产品的香兰素项目实测值为171.6 μg/kg，检测结果不符合GB 2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》要求，结论为该产品不合格。

基于对食品安全的考虑，以及食品添加剂行业的稳定发展，香兰素的检测显然是至关重要的。因此，需要一种经济、选择性好和灵敏度高的检测香兰素浓度的方法。目前，香兰素的检测主要涉及奶粉、米粉、乳制品、植物油、豆浆和天然椰汁等食品，检测方法包括色谱法[6-11]、光谱法[12]和电化学法[13]等。本文对近5年来所报道的香兰素的检测方法以及这些方法的优缺点进行了综述，旨在为各种食品中香兰素的检测提供有效参考，同时也为食品添加剂的合理使用提供技术支持。香兰素结构式见图1。

图1 香兰素结构式Fig.1 The structural formula of vanillin

1 色谱法在香兰素检测中的应用

1.1 气相色谱法

气相色谱法(gas chromatography, GC)是一种在有机化学中对易于挥发而不发生分解的化合物进行分离与分析的色谱技术。此方法操作简单、仪器分析时间短、速度快、干扰小、灵敏度高、样品进样量少[14-15]，适用于香兰素的定性定量分析，是检测香兰素的国标方法。孟庆顺等[16]利用气相色谱法和建立内标物标准曲线法对米粉中的香兰素和乙基香兰素同时进行测定，该方法一次进样分析时间仅为20 min，检测时间短。通过对样品的加标回收和样品中目标物质的反复多次验证，证明该方法回收率较高、重现性较好，是一种操作简单、结果准确的定量检测米粉中香兰素的理想方法。由于不同来源的香兰素样品具有不同的δ13 C值，所以Katryna等[17]使用δ13 C值来对香兰素进行定性，建立了二氯甲烷萃取后馏分中香兰素的分析方法。结果证明该方法具有标准品和样品的可靠性、可重复性和准确性。

然而当检测的样品为热不稳定性样品时，容易造成被测物在空气中的氧化，具有一定的局限性。对于复杂样品的检测也面临着前处理时间长、耗时长等问题，因此在临场分析检测某些样品时受限。

1.2 液相色谱法

液相色谱法是一种流动相为液体的色谱法，通常可分为高效液相色谱法法(high performance liquid chromatography, HPLC)和超高效液相色谱法(ultra high performance liquid chromatography,UPLC)。该方法操作简单、灵敏度高、重现性好、精密度高，适用于各种液体样品中香兰素的检测[18-19]。Édgar等[20]采用高效液相色谱法对可可粉中的香兰素和乙基香兰素进行定量分析。在优化了提取和分离条件后，两种分析物的测定时间均不到4 min，最优条件下的相对标准偏差值均低于2.05%，检出限在0.04～0.06 mg/L之间。陈静等[21]在紫外检测波长267 nm处，结合高效液相色谱法和外标法对液态乳、乳粉、发酵乳、乳酸菌饮料、雪糕和干酪样品中的香兰素进行定量分析。3种香兰素类化合物在0.05～5.00 μg/mL范围内具有良好的线性关系，定量限均为0.2 mg/kg，检出限均为0.06 mg/kg。本方法定量分析速度快、准确性和重复性好，是乳制品中3种香兰素类化合物同时定量检测的理想方法。

传统的高效液相色谱法仍然存在检测灵敏度和效率上的局限性。超高效液相色谱法是一种具有稳定性、易用性、可变灵敏度和选择性等特点，并且在许多方面优于高效液相色谱法的技术，它显示出更好的色谱分离度，分析更灵敏，分析时间更短，能够减少溶剂消耗，其有望替代传统的高效液相色谱法成为新一代食品安全检测技术标准[22-23]。Muhammad[24]建立了一种简便的联用超高效液相色谱-离子色谱法对食品中香兰素和乙基香兰素同时测定的方法，溶剂为体积比为3∶2的乙醇和水，提取方法为快速超声辅助提取。采用IonPac AG19色谱柱作为在线预富集阴离子的浓缩柱。该方法具有成本低、操作简便、稳定性高、在线预处理、灵敏度高、分析时间短(17 min)、所需进样量低(20 μL)等优点，可以成功用于食品中香兰素和乙基香兰素的快速检测。Liu等[25]为了检测蜂蜜中的掺假行为，建立了一种简便、灵敏、准确的高效液相色谱-电化学检测(HPLC-ECD)法同时测定9种蜂蜜中的香兰素类物质。香兰素的检出限为1.3×10-2μg/mL，回收率在80.6%～100.2%之间。高效液相色谱-电子捕获检测器可同时测定蜂蜜中的香味增强剂香兰素，对蜂蜜掺假的鉴别具有重要意义。但是由于实验过程中超高效液相色谱仪所承受的内部压力过大，因此会降低泵的相对使用寿命，加快仪器的连接部位老化速度，一些零件也容易出现故障等，从而增加检测成本。

1.3 色谱-串联质谱法

气相色谱-串联质谱法(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)是利用气相色谱具有的高效分离等优势与质谱的高选择性、灵敏度和分子结构鉴定等优势相结合的方法，具有操作简便、干扰少、定性定量准确的特点，已被应用于食品中有害物质的分析[26-27]。Wang等[28]采用气质联用法测定奶茶中的香兰素和乙基香兰素，在预处理方面采用顶空固相微萃取技术萃取香兰素，内标物为3,4-亚甲二氧苯乙酮，对二者进行定量分析。该方法具有检测灵敏、检测条件绿色、无污染等优点，是一种环境友好的香兰素检测方式。Peng等[29]用同样的方法定量各种食品中的香兰素和乙基香兰素。在确定的最佳条件下，奶茶和婴幼儿配方奶粉的检出限为0.005～0.50 μg/g，混合芝麻油的检出限为0.01～0.05 μg/g。在混合芝麻油中还检测到麦芽酚、乙基麦芽酚和香兰素的含量范围在0.286～1.65 μg/g之间。该方法具有良好的可靠性和同时检测能力，可用于多种食品中4种风味化合物掺假的检测和健康风险评价，然而气相色谱-质谱法的分析时间较长，且仪器价格较贵。

液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)是由具有高效分离能力的液相色谱和具有高准确分析能力的质谱结合，是一种用于化合物定性和定量的重要分析技术。拥有操作简单、高效灵敏、准确可靠等优点，因此被用于实现解析化合物分子结构或样品的定性定量分析[30]。林正锋等[31]采用液相色谱-串联质谱法测定乳制品中的香兰素。该方法对样品中香兰素的提取采用水-醚体系，经碱液反萃除去杂质后采用高灵敏度、高选择性的液相色谱-串联质谱分析4种化合物，整个过程省去了氮吹浓缩的步骤。与其他方法相比，该法具有快速高效，前处理成本低，4种化合物在各种乳制品中呈弱基质抑制效应，无需采用基质曲线或者内标校正补偿其基质效应等优点。Qu等[32]采用高效液相色谱-串联质谱法测定了植物油中的3种香兰素类化合物含量。该方法使用电喷雾三重四极杆进行正离子模式下多反应离子监测，检出限为23～30 μg/kg，定量限为76～100 μg/kg。采用该方法检测了多批次市售植物油，香兰素的检出浓度为160～830 μg/kg。但色谱-串联质谱法同样具有结构复杂，维护成本高，高精密仪器在实验室使用时要经过专门培训的技术职员才能操作，对环境的温度、湿度等要求高，测试速度慢，功能复杂，影响分析工作的效率等不足。

2 光谱法在香兰素检测中的应用

香兰素检测的光谱方法主要包括红外光谱法(FT-IR)、荧光探针法、紫外分光光度法(UV-Vis)等。红外光谱技术是一种快速、无损、绿色、环保的分析技术，常与化学计量学结合，在调味品成分的定量检测与品质评价中有所应用[33-34]。Montserrat等[35]采用傅里叶变换中红外光谱(MID-FTIR)结合化学计量学分析，对纯香草提取物中掺入的乙基香兰素进行鉴别和定量，并通过MID-FTIR光谱进行表征以建立化学计量学模型，采用主成分回归、单变量偏最小二乘和多变量算法建立了香兰素含量的预测模型。结果表明，该技术可以成功地检测到纯香草中掺假的香兰素。Zhao等[36]开发了一种通用模型，用于检测不同品牌婴儿配方奶粉中的香兰素。利用偏最小二乘法判别分析(PLSDA)建立分类模型，识别富含香兰素的像素，该方法的检测限为0.5%。视觉预测图清楚地显示了香兰素富集像素的位置，有利于红外光谱技术在奶粉市场和生产企业质量检测中的应用和推广。

近年来，许多具有优异荧光性能的金属有机骨架(MOF)已经被制备成高灵敏度和高选择性的荧光探针，用于快速检测食品中的香兰素等。Wang等[37]利用钼酸铵辅助形状控制合成Co(II)基纳米MOFs荧光探针用于奶粉中香兰素的检测。在297 nm的紫外光激发下，制得的Co-MOF纳米片在440 nm处发出紫光，且对香兰素高度敏感，并且在水溶液中可以被香兰素选择性猝灭，由此可以进行香兰素的定性检测。此外，Zhu等[38]使用石墨烯量子点(GQD)作为荧光探针选择性检测巧克力中的香兰素。在最佳条件下，GQD的荧光强度与香兰素浓度具有良好的线性关系(0～2.1×105mol/L)，其检测限为2.5×10-8mol/L。对实际样品的检测，香兰素的回收率为88.0%～108.9%，相对标准偏差为0.9%～5.4%。该方法的准确性和精密度良好，可用于各种食品中的香兰素检测。

国际标准ISO 5566中采用紫外可见分光光度法对香兰素的含量进行测定，该方法具有操作简便、灵敏度高、干扰少、准确度好、分析成本低、结果可靠等优点，被人们普遍接受[39]。然而该方法灵敏度较低，因此Altunay[40]建立了一种涡旋辅助离子液体分散微萃取(VAILDME)-紫外-可见分光光度法测定食品中香兰素的新方法。该方法采用乙醇作为分散溶剂、EtSO4作为萃取剂、Cu(II)作为络合剂，在pH 8.0的条件下进行测定。该方法在0.5～300 μg/L范围内呈良好的线性关系，检出限为0.15 μg/L。通过多次加标实验验证了该方法的准确性，加标样品的加标回收率在92.1%～103.0%之间。经验证，采用此方法对食品中香兰素进行测定的结果令人满意。类似地，Zhao等[41]同样建立了一种灵敏、简便、快速的香兰素比色检测方法。在高温酸性条件下，香兰素的醛基可与邻甲苯胺的氨基发生反应。所得产物在363 nm处有最大吸收，最后用紫外分光光度计进行定量。整个样品制备和检测过程不超过20 min，是一种简便、快速、灵敏的香兰素比色检测方法。但光谱法仍然存在检测结果受环境影响较大；光谱干扰受到谱线重叠的影响比较大，所以时而有较差的选择性；样品浓度较大时准确度较低，易受其他物质干扰等局限性。

3 电化学方法在香兰素检测中的应用

电化学方法因具有灵敏度高、操作简单、成本低等优点而被广泛使用，日益成为食品安全质量检测的主要手段[42]。Yiit等[43]使用同样电极测定了饮料中的香兰素，用循环伏安法和方波吸附溶出伏安法研究了这些化合物的电化学行为。在优化条件下的线性电流响应良好，检出限为5.0×10-7mol/L。Filik等[44]则利用聚(茜素红)修饰玻碳电极测定香兰素，在0.5～250 μmol/L范围内，香兰素的检出限为0.06 μmol/L。聚(茜素红)功能化凝胶电泳重现性好，稳定性高。该方法用于能量饮料和香草糖样品中香兰素的测定效果良好。

近年来，许多关于丝网印刷碳电极(SPCE)技术的报道被用于开发各种电化学传感器，用于检测生物医学、环境和农业食品等各个领域的目标分子[45]。Chen等[46]采用市售的一次性多壁碳纳米管丝网印刷电极(CNT-SPE)测定各种香草样品中的香兰素。为香草荚中香兰素快速、灵敏、低成本的定量和常规分析提供了简便的提取方法和电化学检测方法。Murtada等[47]在此基础上研制了一种铝掺杂纳米二氧化钛修饰丝网印刷碳电极(Al-TiO2-NPs/SPCE)用于香兰素的检测。此电极测定的香兰素检出限为0.02 μmol/L，检测时间仅为5 min，比市售香兰素测定电极具有更高的灵敏度和更快的检测速度，可用作香兰素的快速筛选试验应用于常规分析工作中。

碳糊电极(CPE)以其均匀性、低本底电流、制备过程简单、成本效益高、催化性能好、修饰适应性强等优点在传感器的制备方面取得了很大的进展，尤其是对生物分子的检测具有良好的生物相容性[48]。Erady等[49]利用表面活性剂修饰碳糊传感器高效选择性测定食品的香兰素。该方法所用电极为十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)浇铸的CPE，并采用伏安法对电极进行了表征。该电极可较好地消除食品中的阿魏酸、叶酸、色氨酸等干扰物质，对香兰素的选择性良好。Shaaban等[50]建立了一种在磷酸盐缓冲液中利用十二烷基硫酸钠修饰碳糊电极(SDS/CPE)方波伏安法直接测定食品中乙基香兰素和甲基香兰素的新方法。该方法不使用成本高、危害健康的纳米材料。与裸碳糊电极相比，SDS/CPE具有良好的重现性，其相对标准偏差约为0.3%。采用高效液相色谱法验证该电极检测结果的有效性，结果表明，直接伏安法测定乙基香兰素和甲基香兰素经济、可靠，其检测结果与反相高效液相色谱法基本一致。

虽然电化学检测方法在检测香兰素的应用中逐渐受到国内外研究者的青睐，但该方法仍然具有检测过程中存在被测样品或流动相中的杂质，以及实验过程中溶解的氧气等干扰物质，除此之外，温度的浮动等也会对检测结果产生较大的影响；电极使用寿命短；电极间重复性差；受流动性流速的变化影响较大等局限性。

综上所述，食品中香兰素检测方法的应用对比见表1。

表1 食品中香兰素的检测方法Table 1 The determination methods of vanillin in food

4 展望

本文总结了近年来食品中香兰素的检测方法，发现不同的检测方法各有优势和局限性。可根据待测样品的特点根据不同的现场情况选择合适的检测方法，以保证得到准确的检测结果。气相色谱法对于易挥发有机物中的香兰素检测更加适用，但样品的预处理具有操作复杂、处理时间过长等局限性，不适用于临场的快速检测；传统液相色谱法检测速度快、方便操作，但仪器较大，价格较为昂贵，分析时间较长，同样不适合现场的检测；液相色谱-串联质谱法由于具有较低的检出限，应用更为广泛，对样品基质的干扰性较小，用于食品香兰素定量测定准确度高，对多种样品同时大批量的检测同样适用；光谱法操作简单，有些样品无需复杂的前处理，可直接进行检测，分析速度较快，适合于现场的快速无痕检测，但准确度相对较低；电化学方法作为一种新兴的方法，具有响应迅速、灵敏度高、分辨率好等优势，但容易受样品基质干扰，检测大批量产品时较为困难。随着更多的检测方法被应用到香兰素的检测中，检测人员需要根据实际检测目的和环境，选择一种最优的方法来获得香兰素的准确含量，也期盼着研究人员根据现有的检测方法持续改善，持续创新，以研究出更为快速、准确、绿色健康的检测方法。