β-细辛醚对AD小鼠脑中Aβ沉积的影响

牛 康, 陈 瑶, 肖妍妍, 汪惠丽, 陈向涛

(1.合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601; 2.安徽医科大学 药学院,安徽 合肥 230032)

阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)是常见的神经退行性疾病,表现为进行性认知功能障碍和行为损害,从临床症状发作到死亡的平均持续时间约为8.5 a。AD每年新增约4 000 000～6 000 000痴呆症病例,其中中国及其南亚邻国的增长预测最高[1],而且到2050年预计病例数将达到1.15亿,这无疑将给家庭和社会带来巨大的社会和经济负担[2],到目前为止,AD还没有有效的治疗方法[3]。AD的病理特征主要包括老年斑(senile plaque,SP)的沉积、神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle,NFT)和神经元的丢失等[4]。此外,AD患者脑中Aβ的过度产生和积累也会引发随后的病理事件,如突触变性、氧化应激、Tau-过度磷酸化和神经炎症[5-6]。而这些继发性病理事件又可刺激细胞产生新的Aβ,形成了一个恶性循环,加速疾病进展[7-8]。

关于AD的发病机制,目前有多种假说,如β-淀粉样蛋白级联假说、Tau蛋白异常磷酸化假说、胆碱能低下学说、神经免疫炎症反应假说和氧化应激假说等[9]。β-淀粉样蛋白级联是主流的发病机制假说,该假说认为Aβ沉积是造成AD病理发展的主要原因,现有的转基因AD动物模型也大多数从此假说构建而来,如5×FAD转基因小鼠模型,该模型小鼠在4～6月龄时即可产生大量的可溶性Aβ单体,在脑中自发聚集成为寡聚态,直至成为最后的不溶性原纤维沉积,产生了老年斑沉积,进而表现出类似于AD的各种病理表征。

我国传统中药石菖蒲具有开窍豁痰、醒神益智等功效,对癫痫、缺血性脑损伤、阿尔兹海默病、帕金森病等多种神经退行性疾病具有保护作用,而β-细辛醚是其主要活性成分[10]。因此,本文以4月龄的5×FAD转基因小鼠为研究对象,在给予β-细辛醚90 d后,检测小鼠脑中Aβ的沉积情况,这对于评价β-细辛醚的抗AD作用有重要意义,将为后续实验的开展奠定坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验仪器

高速冷冻离心机(CT14RD),徕卡冰冻切片机(Leica),T100聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪(Bio-RAD ),80i荧光显微镜(Nikon),凝胶成像系统、涡漩震荡仪、VE-180凝胶电泳槽(上海天能科技有限公司),移液枪等。

1.1.2 主要试剂

β-细辛醚(纯度为7%,Sigma)、DNA Marker、6×DNA loading buffer、 2×PCR Master Mix、Easy Pure Genomic DNA Kit试剂盒、蛋白酶K(全式金生物技术有限公司),蔗糖、多聚甲醛、氨水、无水乙醇、刚果红、甘油、乙二醇、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠(国药集团化学试剂有限公司),Aβ抗体(上海华雅思创生物科技有限公司),DAPI(C0060,Solarbio),Triton X-100,羊血清,抗荧光猝灭剂,PBS缓冲液,琼脂糖,1×TAE电泳缓冲液。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物

5×FAD雄鼠由中国科技大学实验动物中心提供,饲养在SPF级标准动物房,待其适应1周后,按1∶3的比例与野生型C57雌鼠合笼,母鼠妊娠后待子代1月龄时鉴定其基因型。实验分为对照组(野生型C57雌鼠)、AD模型组(5×FAD雌鼠)和β-细辛醚组。β-细辛醚不溶于水,将其溶解在0.8%的吐温-80溶液中。小鼠4月龄后开始给药。β-细辛醚组每天灌胃给药(10 mg/kg);模型组给予同体积的0.8%的吐温-80溶液,持续90 d。灌胃前一周及灌胃期间,每周测量1次体质量。

1.2.2 小鼠基因型鉴定

按文献[11]方法鉴定5×FAD转基因鼠基因型。剪取小鼠脚趾,按照DNA提取试剂盒中的操作步骤提取小鼠DNA,而后使用PCR仪进行扩增。引物序列如下。

转基因上游引物序列：

5’AGGACTGACCACTCGACCAG,

转基因下游引物序列:

5’CG-GGGGTCTAGTTCTGCAT;

内部阳性对照上游引物序列:

5’CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT,

内部阳性对照下游引物序列:

5’GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC。

以提取到的小鼠cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系(2 μL):转基因上游、下游引物各1 μL,内部阳性对照上游、下游引物各0.5 μL,共计3 μL;2×PCR Master Mix 10 μL,cDNA 2 μL,添加ddH2O至20 μL。反应程序:94 ℃,3 min;94 ℃,30 s;52 ℃,1 min;72 ℃,1 min,35个循环;72 ℃,5 min;停止。之后进行琼脂糖凝胶电泳,判断基因型。

1.2.3 小鼠脑组织的处理和染色

冰冻切片。90 d灌胃结束之后,对小鼠进行心脏灌流、取脑,在4%多聚甲醛中于4 ℃避光浸泡24 h,之后更换浸泡液为30%蔗糖进行脱水,待脑组织沉浸于液体底部后,进行冰冻切片,厚度为40 μm,于防冻液中-20 ℃保存。

刚果红染色。将脑片粘贴于粘附载玻片上,适当晾干,之后分别浸泡在刚果红染色液中15 min、蒸馏水2 min、0.2%碱性乙醇分化液10 s、蒸馏水2 min、苏木精染色2 min、蒸馏水2 min、1%盐酸分化液10 s、蒸馏水2 min 、2%氨水10 s返蓝,之后乙醇梯度脱水、透明并封片,于荧光显微镜下观察。

免疫组织化学染色。首先,将脑片用PBS清洗5 min,共3次,再在0.7% Triton X-100、5%羊血清破膜封闭2 h;PBS清洗5 min，共3次,将脑片在1∶200 PBS稀释的一抗中4 ℃孵育过夜;PBS清洗5 min，共3次,将脑片在1∶5 000 PBS稀释的二抗中室温避光孵育2 h;PBS清洗5 min，共3次,将脑片在1∶10 000 PBS稀释的DAPI中避光孵育8 min;PBS清洗5 min，共3次,在脑片上滴加抗荧光猝灭剂并封片,于荧光显微镜下观察。

2 结果分析

2.1 AD小鼠基因型的鉴定

以小鼠脚趾提取到的cDNA为模板进行PCR扩增,两对引物对应的DNA片段分别为转基因引物基因(片段大小为377 bp),内部阳性对照引物基因(片段大小为324 bp)。内部阳性对照基因片段在每只小鼠中都会表达,但转基因只存在于AD小鼠中,因此2个片段同时存在时才可确定为AD小鼠,如图1所示。

图1 小鼠基因型的鉴定

图1中,因琼脂糖电泳的特性,分子量较小的移动速度较快,从下至上分子量大小依次增大,最左侧为DNA Marker,用以指示相应位置的分子量大小,范围为100～1 000 bp,从下到上3条光带依次对应为引物二聚体、内部阳性对照基因片段和转基因片段,图1红色方框中同时存在2个引物扩增的片段,可确定其对应小鼠基因型为AD。

2.2 β-细辛醚对AD小鼠体质量的影响

在灌胃第7天开始记录体质量,每周记录1次,灌胃期间小鼠体质量变化如图2所示,因实验开始时,小鼠已有4个月的月龄,因此体质量变化并不明显。

从图2可以看出,与对照组小鼠相比,模型组小鼠体质量明显下降,但β-细辛醚灌胃后则出现体质量恢复,与对照组相比并无明显差异。表明当β-细辛醚的每天给药剂量为10 mg/kg时,不仅不会损坏小鼠的机体健康,而且可恢复由溶剂造成的体质量下降情况,对机体有益无害。

图2 灌胃期间小鼠体质量变化

2.3 β-细辛醚对AD小鼠脑中老年斑的影响

脑中产生的Aβ初始为可溶性单体状态,可弥散至整个大脑,因而整个脑区中都会有老年斑的沉积出现,但主要以皮层和海马区域居多,且这2个区域与学习记忆密切相关,因此本文以皮层和海马区域中老年斑沉积的数量为分析指标,研究β-细辛醚是否具有抑制老年斑沉积的效果。

刚果红试剂可与淀粉样蛋白结合,在绿色荧光激发下使老年斑呈现红色,如图3所示。从图3可看出,7月龄的对照组小鼠脑中,无老年斑沉积,表明正常情况下此月龄的野生型小鼠不会表现出AD症状。但在7月龄5×FAD小鼠脑中出现了大量的老年斑沉积,证明5×FAD转基因AD模型可很好的模拟AD患者脑中的Aβ沉积情况,满足研究所需。而通过对比是否给予β-细辛醚的2组5×FAD小鼠脑中老年斑的沉积情况可以看出，与模型组相比,每天用β-细辛醚10 mg/kg灌胃90 d后,可明显减少5×FAD小鼠脑中皮层与海马区域的老年斑沉积数量。

图3 刚果红染色

为进一步验证结果的准确性,本文进行了免疫组织化学染色,结果如图4所示,由图4可知,染色结果与刚果红染色结果一致,β-细辛醚组小鼠脑中的老年斑数量呈下降趋势，不同的是免疫组织化学染色灵敏度比刚果红染色更高,不仅可观测到已形成的老年斑,还可检测到还未聚集、沉积的Aβ淀粉样蛋白,此类蛋白弥散在皮层神经元四周,表明在5×FAD小鼠脑中,其皮层神经元是产生Aβ蛋白的主要地点,为靶向治疗AD提供了一定参考。

图4 免疫组织化学染色

3 讨 论

根据β-淀粉样蛋白级联假说,Aβ的产生和沉积是导致AD发病的核心原因,且已证明了Aβ除本身能够直接造成神经毒性外,也会引起多种细胞毒性作用,包括氧化应激、炎症损伤、细胞内Ca2+水平升高、Tau蛋白过度磷酸化等,最终诱导阿尔兹海默症的病发[5-6]。因此有效抑制Aβ蛋白的生成、减缓或抑制其胞外发生的聚集进程以减少Aβ在脑中的堆积,仍是目前AD研究的重点。

本文从β-淀粉样蛋白级联假说出发,指出β-细辛醚是否可改善AD小鼠脑中老年的沉积情况。首先,大量繁殖扩增5×FAD转基因小鼠,鉴定其子代基因型,为实验所需提供充足的样本量。待其4月龄时,实验组每天给予β-细辛醚剂量为10 mg/kg;模型组则给予同体积的溶剂,即0.8%的吐温-80,持续灌胃90 d。文献[12]研究发现在每天给予大鼠β-细辛醚80 mg/kg、连续7 d的情况下,会导致大鼠虚弱、精神疲劳、体质量减轻甚至死亡,表明β-细辛醚除具有神经保护的药理作用之外,对机体还有一定的毒性作用。因此从3个月灌胃期间小鼠体质量的变化情况可以看出，对照组与β-细辛醚组间无明显差异,证明每天β-细辛醚剂量10 mg/kg长期灌胃不会给机体带来损伤,保证了长期用药的安全性。

在整个灌胃过程结束后,采用刚果红染色和免疫组织化学染色法检测小鼠脑中老年斑的沉积情况,发现2种染色方法所得的结果趋势一致。与模型组相比,β-细辛醚组小鼠脑中皮层和海马区域的老年斑沉积数量明显减少,且由免疫组化染色结果显示,皮层神经元是5×FAD小鼠脑中Aβ产生的主要地点,为AD的治疗提供了一种思路。本文是深入开展β-细辛醚对于AD是否具有治疗作用的基础,根据β-细辛醚可减轻5×FAD小鼠脑中老年斑的沉积情况,为开展后续的相关研究提供支持与依据。