复方芩兰口服液的体内外成分分析和网络药理学研究

许雅婧，乐心逸，葛一蒙，沈龙海，吴 彤，李默影, 3*

复方芩兰口服液的体内外成分分析和网络药理学研究

许雅婧1，乐心逸1，葛一蒙2，沈龙海1，吴 彤1，李默影1, 3*

1.上海医药工业研究院 创新药物与制药工艺国家重点实验室，上海 200437 2.黑龙江珍宝岛药业股份有限公司，黑龙江 虎林 158400 3.江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心，江苏 无锡 214122

采用液质联用技术对复方芩兰口服液的主要化学成分及其进入血液和组织中的成分进行鉴定，并选择主要的体内成分开展网络药理学研究，初步揭示其作用机制。采用UPLC-Q-TOF-MS结合MSE技术进行复方芩兰口服液、血液和组织样本分析，结合精确相对分子质量、保留时间、碎片离子、中性丢失等信息进行复方芩兰口服液的化学成分和体内成分鉴定。利用Cytoscape软件分别构建复方芩兰口服液主要体内成分与其功能主治（感冒、发热、咳嗽、咽痛）之间的“化合物-靶点”作用网络，开展核心靶点和作用通路分析，并采用实时荧光定量PCR对核心靶点中的3个热休克蛋白（HSP90AA1、HSP90AB1、HSPA8）进行生物学验证。大鼠ig给药后在血液样本中检测到3个原型成分和9个代谢产物，组织样本中检测到3个原型成分和5个代谢产物，代谢产物主要为葡萄糖醛酸结合物。网络药理学研究结果提示复方芩兰口服液的作用通路主要与炎症和免疫相关，且生物学验证结果表明上呼吸道感染大鼠肺脏组织中HSP90AA1、HSP90AB1、HSPA8的mRNA表达在给予复方芩兰口服液后显著上调（＜0.01）。利用UPLC-Q-TOF-MS分析复方芩兰口服液的体内外成分并进行网络药理学研究，初步明确了复方芩兰口服液的作用靶点和通路，并选择3个关键靶点进行生物学验证。研究结果为进一步揭示其药效物质基础和作用机制提供科学依据。

复方芩兰口服液；UPLC-Q-TOF-MS；体内成分；网络药理学；“化合物-靶点”作用网络

中药复方是中医药临床应用的主要形式，集中体现了“辨证论治，辅以补中”的治疗原则。由于复方的多成分、多靶点和协同效应，为其作用机制的科学阐述带来了较大困难。网络药理学作为近年来研究中药复方作用机制的新兴学科，使用多种分析工具从大量数据库中提取成分和靶点相关信息，通过建立复方中目标成分对于相关疾病的调控网络，从而揭示复方的作用机制。复方芩兰口服液由金银花、黄芩、连翘、板蓝根4味药材制成，辛凉解表，清热解毒，用于外感风热引起的发热、咳嗽、咽痛[1-2]。虽然前期分析表明复方芩兰口服液成分较为复杂，但只有经消化道直接吸收入血或者经消化道分解成为代谢产物吸收入血，到达靶器官或靶点才能发挥相应的药效。因此本研究首先采用UPLC-Q-TOF-MS对复方芩兰口服液进入正常大鼠的血液和器官组织（肝、心、脾、肺、肾）中的成分进行鉴定，以明确其潜在活性成分，再以此作为目标成分分别构建相对于感冒、发热、咳嗽和咽痛的“化合物-靶点”作用网络，筛选出核心靶点进行通路分析及生物学验证，初步揭示复方芩兰口服液的作用机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters AcquityTM超高效液相色谱系统（美国Waters公司），配置二元泵，自动进样器和PDA检测器；Waters Xevo G2单四级杆飞行时间质谱仪配置电喷雾电离源（美国Waters公司）；Merck Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）；MS105DU型半微量天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；H1850R型台式高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；XH-D型旋涡混合器（上海汗诺仪器有限公司）；DC-12氮吹仪（上海安谱科学仪器有限公司）；SK250HP型超声波清洗器（250 W、53 kHz，上海科导超声仪器有限公司）；T 10 basic ULTRA- TURRAX组织匀浆器（德国IKA集团）；ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪（美国Thermo公司）。

1.2 样品与试剂

复方芩兰口服液（批号B14200301）由黑龙江珍宝岛药业股份有限公司提供。孟鲁司特钠咀嚼片（鲁南贝特制药有限公司，批号16201201）购自上海复美大药房；大前门香烟购自上海烟草集团有限责任公司；脂多糖（LPS）试剂（批号13F-4020）购自Sigma公司；辣椒素（批号93CHRUYK）购自安耐吉化学。对照品蔗糖（批号111507-201704）、绿原酸（批号110753-201716）、连翘苷（批号110821-201615）购自中国食品药品检定研究院；黄芩苷（批号4245）、汉黄芩苷（批号5744）、连翘酯苷E（批号6982）、黄芩素（批号3634）、毛蕊花糖苷（批号3632）购自上海诗丹德生物技术有限公司；新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C均为实验室自制，所有对照品质量分数均大于98.0%。

RNA提取液（Servicebio，G3013）、荧光定量试剂盒（Roche，04913914001）、反转录试剂盒（Thermo，#K1622）购自武汉塞维尔生物科技有限公司；乙腈（LC-MS级）、甲酸（LC-MS级）均购自赛默飞世尔科技公司；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

1.3 实验动物

雄性SD大鼠（SPF级，体质量180～200 g）购自上海斯莱克实验动物责任有限公司，生产许可证号：SCXK（沪）2012-2002，使用许可证号：SYXK（沪）2009-0068），饲养于上海医药工业研究院药理评价研究中心。实验前均适应性喂养7 d [湿度（50±10）%；温度（25±2）℃；12 h昼夜循环]，可自由获取食物和饮用水。动物实验由上海医药工业研究院药理评价研究中心实验动物伦理委员会审查并批准（批件号FW2020-290）。

2 方法

2.1 体内外成分分析

2.1.1 供试品溶液的制备 精密吸取复方芩兰口服液2 mL，加水稀释并定容至10 mL量瓶中，滤过，取续滤液，即得。

2.1.2 对照品溶液的制备 取13种对照品适量，分别加入水或甲醇使溶解，分别配制成质量浓度为0.1 mg/mL的对照品溶液。

2.1.3 动物试验分组、给药及样本处理 12只大鼠随机分为对照组和复方芩兰口服液组，实验前12 h禁食不禁水。按31.5 mL/kg（5倍人用临床剂量折算）ig 给药，对照组给予等体积的生理盐水。给药2 h分别于眼底静脉丛取血后将动物处死，迅速取出心、肝、脾、肺、肾。血浆于4000 r/min离心10 min，取上清液；组织样本用生理盐水冲洗表面，吸干水分，加入3倍量冰生理盐水，用组织匀浆器匀浆，得组织匀浆液；样本均于−80 ℃冰箱保存。

分别精密移取大鼠血清和各组织匀浆液500 μL，加入1 mol/L盐酸50 μL，涡旋60 s，再精密加入1.5 mL甲醇-乙腈（1∶1）的混合液，涡旋60 s，12 000 r/min于4 ℃离心15 min，取上清液氮气吹干，残渣加入100 μL甲醇复溶，涡旋60 s，12 000 r/min于4 ℃离心10 min，取上清液，备用。

2.1.4 液质联用条件

（1）色谱条件：Waters ACQUITY T3 C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B）；柱温为35 ℃；体积流量0.3 mL/min；进样量：5 μL；梯度洗脱：0～3 min，100% A；3～8 min，100%→95% A；8～12 min，95%→85% A；12～18 min，85%→75% A；18～25 min，75%→50% A；25～27 min，50%→20% A；27～28 min，20%→100% A；28～30 min，100% A。

（2）质谱条件：Xevo G2-XS Q-TOF-MS系统，ESI电离源，正、负离子模式。MS参数设置：质量扫描范围为50～1500；干燥气（N2）体积流量为500 L/h，温度400 ℃；电离源温度120 ℃；锥孔气体积流量为100 L/h，电压为40 V；毛细管电压为3.5 kV。在MSE模式下，低碰撞能为6 eV，高碰撞能为25～60 eV。亮氨酸脑啡肽溶液（0.2 ng/mL）作为外标溶液对质量进行实时校正，体积流量为5 μL/min，在负离子模式下/554.261 5 [M－H]−，正离子模式下/556.277 1 [M＋H]+。

2.1.5 数据采集及分析 采用Masslynx 4.1软件进行数据采集并提取各主要质谱峰的信息，根据对照品比对或参考MassBank（http://www.massbank.jp/）数据库中检索得到的质谱图，结合保留时间、准分子离子峰、碎片离子、中性丢失等综合分析，进行复方芩兰口服液的化学成分鉴定。对给药组和对照组样本进行对比分析，提取两组间差异性质谱峰的信息，依据原型成分的裂解碎片及可能的代谢途径，结合保留时间、精确相对分子质量和碎片离子等信息，进行复方芩兰口服液的体内成分鉴定。

2.2 网络药理学研究

2.2.1 靶点预测 以复方芩兰口服液体内成分相关化合物黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、连翘酸、连翘酯苷E、绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C作为目标成分，利用中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/）、Swiss （http://www.swisstargetprediction.ch/）、STITCH（http://stitch.embl.de/）检索相关靶点。以感冒、发热、咳嗽、咽痛作为复方芩兰口服液的主要适应症，应用TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）和OMIM（https://omim.org/）检索相关靶点。分别去除各数据库重复靶点后在Uniprot（https://www.uniprot.org/）中逐一查询各靶点所对应的基因名称并汇总。

2.2.2 蛋白-蛋白相互作用（protein protein interaction，PPI）网络构建 将检索结果按照格式要求整理后导入Cytoscape 3.8.0软件，利用Bisogenet插件分别构建各目标成分相关靶点和各适应症相关靶点的PPI图。由于该插件由多个蛋白质相互作用关系数据库构成，可以在已知靶点的基础上进行广泛的拓展。PPI网络中的节点（node）代表潜在靶点，边（edge）则代表靶点间的相互作用。

2.2.3 核心靶点筛选及网络构建 分别对各目标成分PPI与各适应症PPI取交集，采用CytoNCA插件计算交集靶点的节点连接度（degree）并以其中位数的2倍为卡值[3]，从中筛选出核心靶点，分别构建复方芩兰口服液各适应症的“化合物-靶点”作用网络。

2.2.4 通路富集 利用DAVID（https://david- d.ncifcrf.gov/home.jsp）分别对复方芩兰口服液作用于各适应证的主要靶点进行通路富集分析。

2.3 生物学验证

通过网络药理学分析，选择与复方芩兰口服液4种适应证均密切相关的HSP系列蛋白（HSP90AA1、HSP90AB1、HSPA8），采用实时荧光定量PCR进行靶点验证。

2.3.1 动物分组、造模及给药 30只大鼠随机分组，其中对照组、模型组各7只，复方芩兰口服液组、阳性药组各8只。除对照组外，其余3组大鼠均置于烟熏室进行烟熏造模，每次10只进行烟熏20 min，每日2次，连续10 d。分别于第1、3、7、10天采用LPS诱导上呼吸道感染，方法为大鼠每次滴鼻吸入1 mg/mL LPS溶液，每只大鼠0.2 mL。之后于第11～14天采用辣椒素雾化对大鼠进行呼吸道刺激，5 min/d。

造模后各组大鼠均正常饲养1周，于第8天开始，复方芩兰口服液组和阳性药组分别按照6 mL/kg和0.5 mg/kg（按照临床人用剂量折算）ig给予复方芩兰口服液和孟鲁司特钠，1次/d，连续7 d；同时对照组和模型组每日给予相同体积的生理盐水。给药结束次日将所有大鼠以7%水合氯醛麻醉并处死，取大鼠肺部组织样本，处理同“2.1.3”项，于−80 ℃保存。

2.3.2 PCR检测 引物设计交由武汉塞维尔生物科技有限公司完成，以GADPH（5′-CTGGAGAAA- CCTGCCAAGTATG-3′，5′-GGTGGAAGAATGGGAG TTGCT-3′）作为内参基因，目的序列分别为：HSP90AA1（5′-GCAAGACCGAACCCTCACTATT-3′，5′-CCATTGGTTCACCTGTGTCT-3′）；HSP90AB1（5′-TCAACTTCATCCGTGGTGTGG-3′，5′-GACTG- AGAGGTATGGTAGCGAAG-3′）；HSPA8（5′-AGG- ATTTGCTGCTCTTGGATGT-3′；5′-AAGCAGGTTG- TTGTCCTTGGTC-3′）。

取−80 ℃冻存的大鼠肺脏，每100毫克加入1 mL Trizol提取RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测。PCR扩增条件为95 ℃、10 min 1个循环；95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，40个循环，PCR仪采集荧光信号，熔解曲线为从60 ℃升至95 ℃时，每15秒升温0.3 ℃。以GAPDH为内参基因，通过2−∆∆Ct方法对内参基因t值与待检基因t值进行计算，得出样本间表达量差异倍数关系。

3 结果

3.1 体内外成分鉴定结果

3.1.1 化学成分鉴定结果 复方芩兰口服液在正、负离子模式下的总离子流图如图1所示。共鉴定出32个主要化合物，包括9个有机酸类（奎宁酸、柠檬酸、咖啡酸、绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C）、5个环烯醚萜类（去乙酰车叶草苷酸、五福花苷酸、山栀子苷B、栀子新苷、断氧化马钱苷）、6个黄酮类（山柰酚-3--芸香糖苷、黄芩苷、千层纸素-7--β--葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素）、2个苯乙醇苷类（3,4-二羟基苯乙醇苷、连翘酯苷E）、2个环己醇苷类（连翘环己醇苷B、连翘酸-1′--β-葡萄糖苷）、2个苯丙素类（毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷）、1个木脂素类（连翘苷）和5个其他类（精氨酸、蔗糖、氧化脯氨酸、腺苷、鸟苷）。具体见表1。

3.1.2 入血成分鉴定 对照组和给药组大鼠血清在正、负离子模式下的总离子流图见图2，共鉴定12个入血成分（表2），包括3个原型成分：连翘酯苷E（M2）、黄芩苷（M8）、汉黄芩苷（M11）和9个代谢产物。推测连翘酸-1′--β-葡萄糖苷在大鼠体内经过I相反应中的水解代谢成为苷元连翘酸（M1）。咖啡酰奎宁酸类化合物（绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C）经I相反应中的水解代谢成为咖啡酸，再经过II相反应中的葡糖醛酸化形成咖啡酸葡萄糖醛酸结合物。结合参考文献中的保留时间，鉴定M3和M4分别为咖啡酸-4--β--葡萄糖醛酸和咖啡酸- 3--β--葡萄糖醛酸[4]。黄芩苷经I相反应中的水解形成黄芩素，其5-OH、6-OH和7-OH为代谢活性位点，再经II相反应中的葡糖醛酸化形成单葡萄糖醛酸和双葡萄糖醛酸代谢产物。结合参考文献，鉴定黄芩素-5,7-二葡萄糖醛酸苷（M5）、黄芩素-5,6-二葡萄糖醛酸苷（M6）、黄芩素-6,7-二葡萄糖醛酸苷（M7）、黄芩素-5--β--葡萄糖醛酸苷（M9）和黄芩素-6--β--葡萄糖醛酸苷（M12）5个代谢产物[5]。汉黄芩苷与黄芩苷代谢途径类似，结合参考文献，鉴定其代谢产物汉黄芩素-5--β--葡萄糖醛酸苷（M10）[5]。黄芩素和汉黄芩素也可以直接发生相应的葡萄糖醛酸化反应。

图1 复方芩兰口服液在正离子模式(A) 和负离子模式(B)下的总离子流图

表1 复方芩兰口服液中鉴定的化学成分

Table 1 Identification of the chemical constituents in Fufang Qinlan Oral Liquid

峰号tR/min分子式准分子离子m/z误差(×10−6)碎片离子鉴定结果实测值理论值 10.87C6H14N4O2[M＋H]+175.120 1 175.119 53.43158 [M＋H－OH]+精氨酸 21.28C12H22O11[M－H]−341.108 6341.108 40.59387 [M＋COOH]–蔗糖* 31.92C6H8O7[M－H]−191.018 9191.019 2−1.57173 [M－H－H2O]–, 111 [M－COOH－2H2O]–柠檬酸 42.15C5H7NO3[M＋H]+130.050 1 130.050 4−2.3884 [M－COOH]+氧化脯氨酸 56.41C7H12O6[M－H]−191.055 4191.055 6−1.0585 [M－H－CO－2H2O－C2H2O]–奎宁酸 67.52C14H20O8[M－H]−315.107 6315.108 0−1.27361 [M＋COOH]–, 135 [M－H－Glc－H2O]–3,4-二羟基苯乙醇苷 77.92C10H13N5O4[M＋H]+268.103 9268.104 6−2.61136 [M＋H－Rib]+腺苷 87.95C10H13N5O5[M＋H]+284.099 7 284.099 40.74152 [M＋H－Rib]+鸟苷 98.24C14H24O8[M＋COOH]−365.144 6365.144 8−0.47319 [M－H]−, 161 [M－C8H15O3]−连翘环己醇苷B 108.74C14H24O9[M－H]−335.134 3335.134 20.30155 [M－H－Glc－H2O]−连翘酸-1′-O-β-D-葡萄糖苷 119.82C16H22O11[M－H]−389.108 5389.108 40.26227 [M－H－Glc]−, 191 [M－H－Glc－2H2O]–去乙酰车叶草苷酸 1210.93C16H24O10[M－H]−375.129 2375.129 10.21213 [M－H－Glc]−, 151 [M－H－Glc－H2O－COO]–五福花苷酸 1311.13C16H18O9[M－H]−353.087 5353.087 30.57191 [M－H－C9H6O3]–新绿原酸* 1411.73C20H30O12[M－H]−461.166 3461.165 90.87315 [M－H－Rha]–, 205 [M－H－C6H6O2－Rha]–, 163 [M－H－C8H8O2－Glc]–, 135 [M－H－Glc－Rha－H2O]–连翘酯苷E* 1512.59C16H18O9[M－H]−353.086 4353.087 3−2.55191 [M－H－C9H6O3]–绿原酸* 1612.79C16H22O10[M－H]−373.113 7373.113 50.62193 [M－H－Glc－H2O]–栀子新苷 1712.89C16H18O9[M－H]−353.087 7353.087 31.27173 [M－H－C9H6O3－H2O]–隐绿原酸* 1813.23C9H8O4[M－H]−179.033 4179.034 4−5.59135 [M－H－COO]–咖啡酸 1913.73C17H24O11[M－H]−403.122 9403.124 0−2.73241 [M－H－Glc]–断氧化马钱子苷 2014.61C17H24O11[M－H]−403.124 0403.124 00223 [M－H－Glc－H2O]–山栀子苷B 2115.76C29H36O15[M－H]−623.198 2623.197 60.98477 [M－H－Rha]–, 461 [M－H－C9H6O3]–, 443 [M－H－C9H6O3－H2O]–异毛蕊花糖苷 2216.23C29H36O15[M－H]−623.198 2623.197 60.98477 [M－H－Rha]–, 461 [M－H－C9H6O3]–, 443 [M－H－C9H6O3－H2O]–毛蕊花糖苷* 2316.60C27H30O15[M－H]−593.151 3593.150 61.11447 [M－H－Rha]–, 285 [M－H－Rha－Glc]–山柰酚-3-O-芸香糖苷 2417.36C25H24O12[M－H]−515.119 5515.119 01.07353 [M－H－C9H6O3]–, 173 [M－H－2C9H6O3－H2O]–异绿原酸B* 2517.95C25H24O13[M－H]−515.119 5515.119 01.07353 [M－H－C9H6O3]–, 173 [M－H－2C9H6O3－H2O]–异绿原酸A* 2618.49C25H24O14[M－H]−515.119 5515.119 01.07353 [M－H－C9H6O3]–, 173 [M－H－2C9H6O3－H2O]–异绿原酸C* 2719.75C21H18O11[M－H]−445.077 4445.077 10.72269 [M－H－GluA]–黄芩苷* 2820.35C27H34O11[M＋COOH]−579.208 2579.207 80.76371 [M－H－Glc]–连翘苷* 2920.63C27H34O12[M＋COOH]−579.209 7579.207 83.35371 [M－H－Glc]–, 356 [M－H－Glc－CH3]–千层纸素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 3021.07C22H20O11[M－H]−459.093 1459.092 70.81283 [M－H－GluA]–, 268 [M－H－GluA－CH3]–汉黄芩苷* 3123.36C15H10O5[M－H]−269.045 1269.045 00.41251 [M－H－H2O]–黄芩素* 3224.96C16H12O5[M－H]−283.059 5283.060 6−3.89268 [M－H－CH3]–汉黄芩素

*由对照品确定；Glc-葡萄糖取代基 Rib-核糖取代基 Rha-鼠李糖取代基 GluA-葡萄糖醛酸取代基

*The identification was confirmed with standards; Glc-glucoside Rib-ribosyl Rha-rhamnoside GluA-glucuronic acid

A-空白血清正离子模式 B-含药血清正离子模式 C-空白血清负离子模式 D-含药血清负离子模式

表2 复方芩兰口服液在大鼠体内的入血成分鉴定结果

Table 2 Analysis of absorbed components of Fufang Qinlan Oral Liquid in rat plasma

峰号tR/min分子式准分子离子m/z误差(×10−6)碎片离子鉴定结果实测值理论值 M1 7.04C8H14O4[M－H]−173.080 1173.081 4−7.51 连翘酸 M211.37C20H30O12[M－H]−461.164 5461.165 9−3.04443, 163, 135连翘酯苷E M311.98C15H16O10[M－H]−355.067 5355.066 52.81179咖啡酸-4-O-β-D-葡萄糖醛酸 M412.65C15H16O10[M－H]−355.067 5355.066 52.81179咖啡酸-3-O-β-D-葡萄糖醛酸 M515.25C27H26O17[M－H]−621.109 0621.109 2−0.32445, 269黄芩素-5,7-二葡萄糖醛酸苷 M617.47C27H26O17[M－H]−621.109 0621.109 2−0.32445, 269黄芩素-5,6-二葡萄糖醛酸苷 M717.65C27H26O17[M－H]−621.109 0621.109 2−0.32445, 269黄芩素-6,7-二葡萄糖醛酸苷 M819.09C21H18O11[M－H]−445.078 4445.077 12.92269, 891黄芩苷 M919.68C21H18O11[M－H]−445.074 1445.077 1−6.74269黄芩素-5-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 M1020.19C22H20O11[M＋H]+461.108 3461.108 4−0.22285汉黄芩素-5-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 M1120.86C22H20O11[M＋H]+461.108 3461.108 4−0.22285汉黄芩苷 M1220.94C21H18O11[M－H]−445.078 4445.077 12.92269, 891黄芩素-6-O-β-D-葡萄糖醛酸苷

3.1.3 组织分布成分鉴定 对照组和给药组大鼠各组织样本在正、负离子模式下的总离子流图见图3，共鉴定3个原型成分和3个代谢产物（表3）。发现肝脏、肺脏、肾脏是复方芩兰口服液的主要作用器官，其中的代谢成分主要经I相代谢反应中的水解和II相代谢反应中的葡萄糖醛酸化形成。通过对复方芩兰口服液的化学成分和体内成分进行分析，发现其中的多种咖啡酰奎宁酸类成分，黄芩苷、汉黄芩苷及其相应的苷元、连翘酯苷E和连翘酸-1′-- β-葡萄糖苷是其进入大鼠血液和组织的主要成分，可能是复方芩兰口服液的潜在活性成分。

A-空白组织正离子模式 B-含药组织正离子模式 C-空白组织负离子模式 D-含药组织负离子模式

表3 复方芩兰口服液于大鼠各器官组织中吸收成分鉴定结果

Table 3 Analysis of absorbed components of Fufang Qinlan Oral Liquid in rat organ tissue

峰号tR/min分子式准分子离子m/z误差(×10−6)碎片离子鉴定结果分布器官实测值理论值 M′111.37C20H30O12[M－H]−461.166 2461.165 90.65315, 205连翘脂苷E心、肺 M′212.35C16H18O9[M－H]−353.084 7353.087 3−7.37191, 179绿原酸肺 M′317.16C27H26O17[M－H]−621.109 0621.109 2−0.32445, 269黄芩素-5,6-二葡萄糖醛酸苷肝、肾 M′417.42C27H26O17[M－H]−621.109 0621.109 2−0.32445, 269黄芩素-6,7-二葡萄糖醛酸苷肝、肾 M′519.45C28H28O17[M－H]−635.122 1635.124 8−4.25459汉黄芩素-5,7-二葡萄糖醛酸苷肝、肾 M′620.92C22H20O11[M＋H]+459.093 5459.092 71.74445, 268汉黄芩苷心、肺、肾

3.2 网络药理学研究

3.2.1 “化合物-靶点”网络构建 以检索得到的已知靶点为基础分别构建各目标成分和各适应证的PPI网络，结果见表4。由于绿原酸和新绿原酸，异绿原酸B和异绿原酸C分别为对映异构体，检索结果和所构建的网络均相同。连翘酸-1′--β-葡萄糖苷在数据库中无法检索到相关靶点，因此选择其在体内代谢得到的苷元进行靶点检索。

分别对各目标成分PPI与各适应证PPI取交集，以degree值中位数的2倍为卡值得到的单一化合物与适应证之间的核心靶点。由于核心靶点仍然数量众多，所构建的网络过于复杂，进行通路分析缺乏针对性。因此选择degree值排名前10%的靶点分别构建复方芩兰口服液各适应证的“化合物-靶点”作用网络。具体见图4。外圈蓝色靶点仅与少数化合物相关（≤3），而内圈黄色靶点均受到多个目标成分调控（＞3），为复方芩兰口服液的关键作用靶点。

表4 各PPI网络所得靶点及相互作用数量

Table 4 Number of targets and interactions of each PPI network

PPI网络靶点数量靶点间相互作用数量PPI网络靶点数量靶点间相互作用数量 黄芩苷176527 112隐绿原酸297935 094 黄芩素6386136 250异绿原酸A372553 688 汉黄芩苷7567473异绿原酸B（异绿原酸C）333642 575 汉黄芩素6942147 508咳嗽114818 440 连翘酸119917 259发热314369 304 连翘酯苷E7606546感冒279664 997 绿原酸（新绿原酸）309239 169咽痛200637 058

A-感冒 B-发热 C-咳嗽 D-咽痛，代表化合物 代表靶点

3.2.2 通路富集及分析 对复方芩兰口服液调控感冒、发热、咳嗽、咽痛的关键靶点分别进行通路富集，并对4种适应证均相关的作用通路进行总结，结果见表5。提示复方芩兰口服液的作用通路主要与炎症和免疫密切相关[6-10]。

3.2.3 生物学验证 各组大鼠肺脏中3个HSP系列蛋白的表达水平见表6。结果表明模型大鼠肺脏中HSPA8和HSP90AB1的mRNA表达水平较正常大鼠显著上升（＜0.05），HSP90AA1也有一定的上升趋势，提示了大鼠肺部出现了炎症反应，咳嗽和炎症的复合模型造模成功。给予复方芩兰口服液后，以上3个指标均出现了极显著上调（＜0.01），且程度均优于临床常用止咳药孟鲁司特钠咀嚼片。说明HSP系列蛋白可能是复方芩兰口服液发挥消炎止咳作用的关键靶点。

表5 复方芩兰口服液主要作用靶点和通路

Table 5 Primary targets and pathways of Fufang Qinlan Oral Liquid

主要作用通路主要作用靶点 estrogen signaling pathwayHSPA8, HSP90AA1, HSP90AB1, ESR1, EGFR, AKT1, GRB2 prostate cancerHSP90AA1, HSP90AB1, EP300, CDK2, MDM2, AKT1, GRB2, IKBKG, EGFR PI3K-Akt signaling pathwayHSP90AA1, HSP90AB1, CDK2, MDM2, AKT1, GRB2, IKBKG, YWHAZ, EGFR, FN1, BRCA1 pathways in cancerNTRK1, HSP90AA1, HSP90AB1, HDAC1, EGFR, CASP3, TRAF6, CDK2, MDM2, AKT1, EP300, GRB2, IKBKG cell cycleHDAC1, CDK2, MDM2, CUL1, EP300, YWHAZ, MCM2 NOD-like receptor signaling pathwayHSP90AA1, HSP90AB1, TRAF6, IKBKG

表6 各组大鼠肺脏中HSPA8、HSP90AA1和HSP90AB1的mRNA表达水平

Table 6 mRNA Expression of HSPA8, HSP90AA1 and HSP90AB1 levels in rats lung of each group

组别相对表达量 HSPA8HSP90AA1HSP90AB1 对照1.11±0.261.49±0.451.04±0.41 模型1.19±0.18#1.58±0.411.13±0.38# 复方芩兰口服液1.50±0.35**2.20±0.50***1.34±0.25*** 阳性对照1.43±0.53*1.61±0.631.13±0.38*

与对照组比较：#＜0.05；与模型组比较：*＜0.05**＜0.01***＜0.001

#< 0.05control group；P < 0.05**< 0.01***< 0.001model group

4 讨论

本实验采用液质联用对复方芩兰口服液的体内外成分进行研究。取样时间点上考察了0.5、1、2、4、6 h多个时间点，发现给药后2 h在大鼠的血清和组织样本中可检测到的移行成分最多，故将其作为最佳的采样时间点。样本处理方法比较了甲醇沉淀蛋白、乙腈沉淀蛋白及沉淀蛋白后采用醋酸乙酯进行萃取等处理方式，结果均不理想，最终采用本实验的处理方法。样本分析所采用的UPLC-Q- TOF-MS结合MSE技术能够通过一次数据采集获得高精确度和高分辨率的全部母离子与碎片离子信息，从而较为全面、真实、快速的定性大鼠血液和组织样本中的移行成分。

给药后在大鼠的血清中共鉴定3个原型成分和9个代谢产物，组织样本中共鉴定3个原型成分和3个代谢产物。通过与单味药材图谱进行对比，其中咖啡酸葡萄糖醛酸由多种咖啡酰奎宁酸类成分代谢得到，和绿原酸一起主要来自金银花。连翘酸和连翘酯苷E来自连翘。黄芩苷、汉黄芩苷及其苷元的多种葡萄糖醛酸产物来自黄芩。多项药理研究表明这些成分具有广泛的抗炎、抗菌、抗氧化和免疫调节等药理作用[11-18]，可能是复方芩兰口服液辛凉解表、清热解毒的潜在活性成分。

网络药理学研究结果表明复方芩兰口服液可以通过多通路多靶点发挥疗效，通过富集分析发现主要的作用通路多包含HSP系列蛋白。在热休克蛋白家族中，HSP90具有特殊的分子伴侣功能。其广泛参与了众多细胞增殖和调亡的信号调控，在炎症反应中起着重要作用。HSP90可以和受体相互作用蛋白激酶（receptor-interacting protein kinase，RIP）相互作用并使其稳定。RIP在肿瘤坏死因子α的刺激下结合到肿瘤坏死因子受体上，从而激活核转录因子[19]。因此推测HSPA8、HSP90AA1和HSP90AB1可能是复方芩兰口服液发挥抗炎作用的重要靶点，并且在大鼠咳嗽和炎症的复合模型中得到证实。

本研究首次对复方芩兰口服液的体内外成分进行分析，并在明确潜在活性成分的基础上首次构建了相关适应证的“化合物-靶点”作用网络，初步揭示其主要作用靶点及通路。研究结果为揭示复方芩兰口服液的药效物质基础和作用机制提供了一定基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

[1] 王东升, 吴力群, 张维, 等.复方芩兰口服液治疗儿童急性上呼吸道感染（风热感冒证）多中心随机对照临床研究 [J].药物评价研究, 2021, 44(4): 774-779.

[2] 鲍岩岩, 高英杰, 周利润, 等.复方芩兰口服液对呼吸道病毒感染的药效作用[J].世界中医药, 2021, 16(12): 1809-1817.

[3] 徐海玉, 刘振明, 付岩, 等.中药整合药理学计算平台的开发与应用 [J].中国中药杂志, 2017, 42(18): 3633-3638.

[4] 魏玲, 周茂金, 张铁军, 等.咖啡酸在大鼠体内两个葡萄糖醛酸结合物的分离与鉴定 [J].中草药, 2010, 41(6): 949-952.

[5] 杜占权.黄芩化学成分及其提取物大鼠体内代谢的研究 [D].沈阳: 沈阳药科大学, 2012.

[6] Keselman A, Heller N.Estrogen signaling modulates allergic inflammation and contributes to sex differences in asthma [J]., 2015, 6: 568.

[7] Liu X Q, Cohen J I.The role of PI3K/Akt in human herpesvirus infection: From the bench to the bedside [J]., 2015, 479/480: 568-577.

[8] Liu P, Lu Z W, Liu L L,.NOD-like receptor signaling in inflammation-associated cancers: From functions to targeted therapies [J]., 2019, 64: 152925.

[9] Tan T T, Coussens L M.Humoral immunity, inflammation and cancer [J]., 2007, 19(2): 209-216.

[10] Mantovani A, Garlanda C, Allavena P.Molecular pathways and targets in cancer-related inflammation [J]., 2010, 42(3): 161-170.

[11] 余盼, 李冬冬, 萧伟, 等.绿原酸衍生物构效关系的研究进展 [J].中国药物化学杂志, 2018, 28(2): 144-156.

[12] 王庆华, 杜婷婷, 张智慧, 等.绿原酸的药理作用及机制研究进展 [J].药学学报, 2020, 55(10): 2273-2280.

[13] 曲欢欢.连翘化学成分和生物活性研究 [D].西安: 西北大学, 2008.

[14] 付鹏亮, 王东强, 李志军.连翘酯苷药理作用研究进展 [J].长春中医药大学学报, 2011, 27(6): 1062-1063.

[15] 陈涛.中药黄芩及其主要成分抗炎活性的研究 [D].长春: 吉林大学, 2017.

[16] 申云富, 范小青.汉黄芩苷的药理活性研究进展 [J].上海中医药大学学报, 2016, 30(4): 98-101.

[17] 张沂, 穆杰, 高伟华, 等.基于网络药理学从系统层面探讨黄芩苷治疗肺纤维化的效应机制研究[J].世界中医药, 2020, 15(10): 1373-1380

[18] 张艳.黄芩苷和黄芩素的抗炎和免疫调控作用研究 [D].上海: 第二军医大学, 2012.

[19] Sevin M, Girodon F, Garrido C.HSP90 and HSP70: Implication in inflammation processes and therapeutic approaches for myeloproliferative neoplasms [J]., 2015, 970242: 1-9.

andcomponent analysis and network pharmacology study of Fufang Qinlan Oral Liquid

XU Ya-jing1, YUE Xin-yi1, GE Yi-meng2, SHEN Long-hai1, WU Tong1, LI Mo-ying1, 3

1.State Key Laboratory of New Drug and Pharmaceutical Process, Shanghai Institute of PharmaceuticalIndustry, Shanghai 200437, China 2.Heilongjiang Zhenbaodao Pharmaceutical Co., Ltd., Hulin 158400, China 3.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Chiina

Liquid mass spectrometry was used to identify the chemical constituents of Fufang Qinlan Oral Liquid (复方芩兰口服液) and its metabolites in rat.The maincomponents were selected for network pharmacological and the mechanism was initially revealed.Fufang Qinlan Oral Liquid, serum and tissue samples were analyzed by UPLC-Q-TOF-MS combined with MSEtechnique, and the identification ofandcomponents were carried out with the information of precise molecular weight, retention time, fragment ions and neutral loss.Cytoscape software was used to construct the “compound-target” network between the maincomponents and the main clinical indications (cold, fever, cough and sore throat).Core targets and pathway analysis were also conducted, in which HSP90AA1, HSP90AB1 and HSPA8 were measured by realtime PCR.Three prototype components and nine metabolites were characterized in rat serum after ig administration, so as three prototype components and five metabolites in rat tissues.The metabolites were mainly glucuronide conjugates.The results of network pharmacology indicated that the pathways of Fufang Qinlan Oral Liquid were mainly related to inflammation and immunity.Compared with model rats, the expression of HSP90AA1, HSP90AB1, and HSPA8 was significantly increased after intragastric administration of Fufang Qinlan Oral Liquid (＜0.01).Thecomponents were preliminarily analyzed after oral administration of Fufang Qinlan Oral Liquid by UPLC-Q-TOF-MS and the network pharmacology study was then carried out, which initially clarified the targets and pathways.The studies provided scientific basis for pharmacodynamic material basis and mechanism of Fufang Qinlan Oral Liquid.

Fufang Qinlan Oral Liquid; UPLC-Q-TOF-MS;metabolite; network pharmacology; “compound-target” network

R284.1

A

0253 - 2670(2022)09 - 2623 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.09.004

2021-11-12

许雅婧，女，硕士研究生，研究方向为生药学专业。E-mail:1796958002@qq.com

通信作者：李默影，女，博士，从事天然药物活性成分及作用机制研究。E-mail: wuweisong2009@126.com

[责任编辑 王文倩]