降钙素基因相关肽对LPS并ATP诱导小胶质细胞NLRP3炎症小体激活影响

郭蜜　向建琴　张健　李忠正　邱继文　崔银洁

[摘要]目的探討降钙素基因相关肽（CGRP）对脂多糖（LPS）联合三磷酸腺苷（ATP）诱导的BV2小胶质细胞NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体活化的抑制作用。方法通过检测不同方法处理的各组细胞NLRP3蛋白含量，确定LPS联合ATP激活小胶质细胞最佳模型并筛选CGRP最佳作用浓度。实验分为对照组、模型组以及CGRP组，采用蛋白免疫印迹法检测细胞NLRP3、凋亡相关的斑点样蛋白（ASC）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（caspase-1）的表达，酶联免疫吸附试验法检测细胞内炎性因子白细胞介素1β（IL-1β）的表达。结果BV2小胶质细胞NLRP3炎症小体激活最佳模型的制备方法为先加入100 μg/L的LPS作用12 h，再加入5 mmol/L的ATP继续作用45 min;CGRP抑制NLRP3炎症小体激活的最佳浓度为10 μg/L。模型组细胞NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β的蛋白表达较对照组明显升高，CGRP组细胞上述蛋白表达较模型组明显降低，差异均有显著性（F=7.261～151.232，P<0.05）。结论CGRP可能通过抑制BV2小胶质细胞NLRP3炎症小体激活，发挥抗炎神经保护作用。

[关键词]降钙素基因相关肽;NLR家族，热蛋白结构域包含蛋白3;小神经胶质细胞;脂多糖类;腺苷三磷酸;神经保护

[中图分类号]R364.5;R338[文献标志码]A[文章编号]2096-5532（2022）02-0229-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.053[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版]https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20220320.1554.016.html;2022-03-2209：00：53

EFFECT OF CALCITONIN GENE-RELATED PEPTIDE ON THE ACTIVATION OF NLRP3 INFLAMMASOME INDUCED BY LPS AND ATP IN MICROGLIAGUO Mi， XIANG Jianqin， ZHANG Jian， LI Zhongzheng， QIU Jiwen， CUI Yinjie （Research Center of Experimental Acupuncture Science， Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 301600， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of calcitonin gene-related peptide （CGRP） on the activation of nod like receptor thermoprotein domain associated protein 3 （NLRP3） inflammatory bodies in BV2 microglia induced by lipopolysaccharide （LPS） combined with adenosine triphosphate （ATP）.MethodsBy detecting the content of NLRP3 protein in cells with different treatment methods， the best model of LPS combined with ATP activated microglia was determined， and the best concentration of CGRP was screened. The experiment was divided into control group， model group and CGRP group. The protein expressions of NLRP3， apoptpsis-associated speck-like protein containing （ASC） and cysteinyl aspartate specific protease-1 （caspase-1） were detected by Western blot; Quantitative detection of intracellular inflammatory factor interleukin-1β protein expression by enzyme-linked immunosorbent assay. ResultsThe best model of NLRP3 inflammasome activation in BV2 microglia was prepared with 100 μg/L LPS used for 12 h， and then 5 mmol/L ATP was added for 45 min; the optimal concentration of CGRP to inhibit NLRP3 inflammasome activation was 10 μg/L. Compared with the control group， the expression of NLRP3， ASC， caspase-1 and IL-1β in model group was significantly higher; compared with the model group，the expression of NLRP3， ASC， caspase-1 and IL-1β decreased significantly （F=7.261-151.232， P<0.05）. ConclusionCGRP can play an anti-inflammatory and neuroprotective role by inhibiting the activation of NLRP3 inflammatory bodies in BV2 microglia.

[KEY WORDS]calcitonin gene-related peptide; NLR family， pyrin domain-containing 3 protein; microglia; lipopolysaccha-rides; adenosine triphosphate; neuroprotection

小胶质细胞在中枢神经系统的免疫调节过程中发挥核心作用[1]。研究发现，小胶质细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）在人类轻度认知障碍和阿尔兹海默病（AD）等神经变性疾病中发挥着重要的作用[2-3]。NLRP3作为最具有特色的炎症小体，是胞浆内识别受体NOD样受体家族的一员，当细胞受到感染、组织损伤等刺激时，被激活的NLRP3能够通过結合凋亡相关的斑点样蛋白（ASC）招募半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（caspase-1）前体形成NLRP3炎症小体，从而促进caspase-1前体激活成为caspase-1，诱导白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素18（IL-18）的成熟[4]。降钙素基因相关肽（CGRP）是一种神经肽类物质，可以直接作用于巨噬细胞和树突状细胞，抑制IL-1β的生成与释放[5-7]。本团队前期研究显示，CGRP可以改善脊髓损伤大鼠的运动功能，抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的表达，具有神经保护作用，但其分子机制仍不清楚[8]。NLRP3炎症小体的激活能够促进大量IL-1β的产生，而CGRP可以抑制IL-1β的生理功能，CGRP与NLRP3炎症小体之间可能存在着一定的联系。为了进一步探明二者关系，本研究采用脂多糖（LPS）与三磷酸腺苷（ATP）诱导的BV2小胶质细胞炎症小体激活模型，从NLRP3炎症小体途径探讨CGRP的神经保护机制。

1材料与方法

1.1实验材料

BV2小胶质细胞，购自Santa Cruz Biotechno-logy公司。胎牛血清（Cell Signaling Technology）;LPS（爱必信）;ATP（FERMRNTAS）;β-actin（Santa Cruz Biotechnology）;CGRP抗体（北京义翘神州科技有限公司）;ASC、caspase-1和NLRP3抗体（abcam）;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）;BCA蛋白定量试剂盒（博士德生物工程有限公司）;ECL显影液和PVDF膜（Millipore）;HRP标记二抗（Sigma）。全波长酶标仪（Bio-tek，ELX 800）;垂直电泳装置（北京市六一仪器厂，DYCZ-24DN）;CO2恒温培养箱（ThermoForma，form 1341）;LabWorksTM凝胶成像及分析系统（美国UVP公司，GelDoc-It310）。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养与传代BV2小胶质细胞置于含体积分数0.10胎牛血清和10 g/L双抗的RPMI 1640培养液中，放于37 ℃的CO2细胞培养箱中，待细胞生长融合率80%时传代，隔2 d传代1次，传代3次后且细胞状态良好时用于后续实验。

1.2.2LPS联合ATP激活小胶质细胞最佳模型确定及CGRP最佳剂量筛选将细胞分为6组，依据有关文献确定两种细胞模型处理条件[9-11]。对照组细胞用含体积分数0.10胎牛血清的DMEM/F12培养液培养;模型1组细胞先加入100 μg/L的LPS作用12 h，然后再加入5 mmol/L的ATP继续作用45 min;模型2组细胞先加入100 μg/L的LPS作用4 h，然后再加入5 mmol/L的ATP继续作用45 min;CGRP1、CGRP10、CGRP100组细胞先分别用1、10、100 μg/L的CGRP预处理1 h，然后加入100 μg/L的LPS作用12 h，再加入5 mmol/L的ATP继续作用45 min。根据NLRP3蛋白含量筛选出最佳模型和CGRP的最佳作用浓度进行后续实验。

1.2.3细胞NLRP3、capase-1、ASC蛋白表达的检测采用蛋白免疫印迹法检测对照组（A组）、模型组（按筛选出的最佳模型制备方法进行处理，B组）、CGRP组（按筛选出的最佳作用浓度的CGRP进行处理，C组）细胞中NLRP3、capase-1和ASC的含量。样品裂解后提取蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，浸入脱脂奶粉封闭液中，室温下于摇床上轻轻摇动2 h;然后分别加入兔抗人单克隆NLRP3抗体（1∶100）、ASC抗体（1∶50）、capase-1（1∶200）抗体以及兔抗人多克隆GAPDH抗体（1∶500）4 ℃孵育过夜。TBS-T洗膜后，将膜于含对应二抗（HRP标记二抗）的脱脂奶粉溶液中，室温作用1.5 h，用ECL显影液显影，用LabWorksTM凝胶成像及分析系统摄像，分析条带的光密度值。

1.2.4细胞IL-1β表达的ELISA检测收集对照组、模型组和CGRP组的细胞培养上清液，严格按照IL-1β检测试剂盒的说明进行检测。反应终止后使用全波长酶标仪于450 nm波长处检测吸光度值，根据标准品浓度和吸光度值做标准曲线，计算各组样本吸光度值对应的浓度值。

1.3统计学分析

应用SPSS 23.0软件进行统计学分析。计量资料结果以x±s表示，先进行方差齐性检验，方差齐则组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法;方差不齐则组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1最佳模型与CGRP最佳作用浓度

对照组、模型1组、模型2组以及CGRP1、CGRP10、CGRP100组NLRP3蛋白表达量分别为0.215±0.003、0.394±0.006、0.303±0.002、0.054±0.000、0.036±0.000、0.047±0.000（n=3）。对照组、模型1组、模型2组NLRP3表达量比较差异有统计学意义（H=7.200，P<0.05），其中模型1组NLRP3蛋白表达量最高，因此选择模型1为最佳模型进行后续实验。对照组、模型1组以及CGRP1、CGRP10、CGRP100组NLRP3表达量比较差异有统计学意义（H=13.573，P<0.05），其中CGRP10组NLRP3蛋白表达量最低，因此选择10 μg/L的CGRP进行后续实验。见图1。

2.2CGRP对NLRP3、ASC、capase-1和IL-1β蛋白表达的影响

模型組细胞NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β的蛋白表达较对照组明显升高，CGRP组细胞上述蛋白表达较模型组明显降低，差异均有显著意义（F=7.261～151.232，P<0.05）。表明CGRP可以抑制炎症小体NLRP3的激活从而减轻炎症反应。见图2和表1。

3讨论

NLRP3炎症小体异常活化产生的过度炎症反应与人类多种疾病密切相关，其中包括AD、脊髓损伤等神经系统疾病[12-13]。已有实验研究结果表明，在AD模型中，NLRP3基因敲除的小鼠空间记忆能力显著提升，运动功能障碍与多巴胺能神经元退行性病变得以改善[14];在脊髓损伤模型中，小胶质细胞内的NLRP3炎症小体活化，并进一步激活核转录因子κB（NF-κB）信号通路，形成级联式炎症反应，加速神经元的死亡[15]。因此，抑制NLRP3炎症小体的过度激活可能是预防或治疗神经炎性疾病的关键。

研究发现，体外NLRP3炎症小体的激活需要两个信号：信号1是指当细胞受到LPS的刺激时，Toll样受体4（TLR4）迅速识别，激活NF-κB通路，导致pro-IL-1β和NLRP3蛋白水平的上调;信号2是指高浓度ATP刺激P2X7，导致K+外流，促进ASC和caspase-1的集合，从而导致NLRP3炎症小体的激活[16]。有研究表明，将ATP与LPS联合激活NLRP3炎症小体，可以缩短作用时间，并且刺激效果更显著[17]。但文献中未报道LPS联合ATP激活BV2小胶质细胞NLRP3炎症小体的具体浓度与反应时间。因此，本研究首先通过实验确定LPS联合ATP激活BV2小胶质细胞NLRP3炎症小体的最佳模型，结果表明，先以100 μg/L的LPS作用12 h，然后再以5 mmol/L的ATP继续作用45 min，小胶质细胞中炎症小体的激活最为显著，因此选用该浓度和反应时间建立体外小胶质细胞NLRP3激活模型。

CGRP为一种由37个氨基酸构成的多功能神经肽，是目前已知最强的扩血管物质，尤其对脑血管扩张具有极强的作用[18]。在免疫炎症方面，CGRP具有抗炎和促炎双向调节作用。例如，注射CGRP后，烟曲霉感染的真菌性角膜炎小鼠角膜组织中的IL-1β水平明显降低，角膜炎症状随之减轻，CGRP发挥了抗炎作用[19];而在偏头痛模型中，CGRP则通过一系列反应参与三叉神经血管系统信号转导，促进神经源性炎症从而引发偏头痛[20]。为了进一步了解CGRP在炎症中的作用，本研究将不同浓度的CGRP作用于BV2小胶质细胞，结果表明CGRP可以显著抑制NLRP3炎症小体的激活，但该作用并不呈浓度依赖性。因此我们推测，CGRP发挥抗炎和促炎的不同作用可能与其组织特性有关。既往有研究还表明，CGRP具有神经保护作用，该作用可能与CGRP抑制低氧海马神经元c-fos的表达，降低高阈值钙电流，抑制低氧时细胞外钙离子内流有关[21]，但其具体机制尚不很清楚。本团队在研究CGRP与炎症关系时显示，CGRP和NLRP3炎症小体之间存在着千丝万缕的关系：CGRP可以抑制IL-1β和抗原呈递细胞，而NLRP3炎症小体的激活则可以促进IL-1β的表达[22];对比CGRP与NLRP3细胞内激活与传递途径显示，二者存在共同的信号通路cAMP/PKA[23-24]。因此，我们推测CGRP与NLRP3之间可能存在一定的调控关系，故而设计了本次实验。本文结果表明，CGRP可以降低LPS联合ATP诱导的BV2小胶质细胞中NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白含量，减少细胞中IL-1β的表达，提示CGRP可以抑制小胶质细胞中NLRP3炎症小体的激活。本研究揭示了CGRP神经保护的又一作用机制，为临床上CGRP治疗神经炎性疾病提供了实验依据。

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（本文编辑马伟平）