化学发光法检测超高值样本最佳稀释比例的获取方法

袁应选， 袁 琳， 汪 珍， 陈 超

（1.西安电力中心医院检验科，陕西 西安 710032；2.西安市第一医院检验科，陕西 西安 710000；3. 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司，广东 深圳 518000）

恶性肿瘤的临床诊断、术后以及放化疗的疗效观察均需要一个重复性较好的肿瘤标志物检测结果进行指导。临床上人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，hCG）、癌胚抗原、甲胎蛋白、前列腺特异性抗原等肿瘤标志物的浓度范围往往跨度非常大，低值、中值、高值、超高值样本在临床上经常遇到，但无论是哪个浓度值区间的样本，均需通过规范化检测才能得到其准确的测定值[1-3]。化学发光法易受反应条件，如pH值、离子强度、溶液组成、温度等的影响[4]。这些影响因素主要体现在超高值样本稀释时对稀释液的选择上。根据抗原抗体结合反应动力学原理，稀释比例是免疫结合反应的重要影响因素之一，对样本的准确检测可能存在较为显著的影响，而等价带区域是这类免疫检测的理想区域[5]。因此，有必要对稀释比例进行精确选择。本研究以hCG项目检测为例，探讨关于化学发光法检测浓度超高值样本最佳稀释比例的获取及使用方法。

1 材料和方法

1.1 样本来源

收集2019年6月—2020年12月西安电力中心医院产科门诊送检的hCG超高值（＞5 000.0 mIU/mL）血液样本。

1.2 仪器与试剂

MAGLUMI 4000 Plus全自动化学发光免疫分析仪（深圳新产业公司）及配套hCG试剂盒（批号0171900401）。质控品购自美国伯乐公司（批号40382）。

1.3 方法

各实验室在制作定标曲线时均会使用高、低值定标品，这为实验室间检测结果的比对打下基础。鉴于本研究探讨的是超高值样本检测，为了能更有效地发挥定标曲线的性能，我们选择定标曲线高值定标点所对应的相对光强度（relative light unit，RLU）值（1 319 511）作为实验室间检测结果比较的参照点。

采用试剂盒配套的稀释液（成分为小牛血清加0.2%叠氮钠）对1份初测（1∶100稀释[6]）hCG浓度为292 613.3 mIU/mL的超高值血清样本按仪器给定的系列稀释比例（仪器说明书提供的可自动稀释的比例为1∶2、1∶4、1∶5、1∶10、1∶20、1∶50、1∶90、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1 000、1∶2 500）进行自动稀释检测[6-7]，检测3次，取平均值。将收集的222份hCG超高值样本用相同方法稀释后进行检测。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计分析。呈正态分布的数据以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 最佳稀释比例的获取

在对1份超高值血清样本[初测（1∶100稀释）hCG为292 613.3 mIU/mL]按仪器给定的系列稀释比例进行自动稀释检测的结果中，原倍血清及1∶20、1∶50稀释的检测结果存在明显的稀释不足现象（后带效应），1∶500及以上稀释的检测结果存在过度稀释现象，见表1。

表1 hCG超高值样本系列稀释后的检测结果

在所有hCG超高值样本的系列稀释结果中，RLU测值最接近高值定标品RLU参数值时所对应的稀释比例应为最佳的稀释比例，由最佳稀释比例换算所得的值则为较稳定且准确的测定值。故针对该份样本求得的最佳稀释比例为1∶200。

2.2 同一份超高值样本不同稀释比例稀释以及最佳稀释比例下的检测结果分析

采用表1中的任意稀释比例，对1份hCG超高值样本进行稀释并重复检测20次，hCG检测结果为（351 708.9±73 191.5）mIU/mL，CV为20.81%。按最佳稀释比例（1∶200），对同一份hCG超高值样本重复检测20次，hCG检测结果为（308 669.5±10 247.8）mIU/mL，CV为3.32%。2个检测结果差异有统计学意义（t=-2.917，P=0.006）。

将该份hCG超高值样本分装成20份，外送至使用相同检测系统的实验室，采用最佳稀释比例（1∶200）进行稀释并检测，hCG结果为（309 537.9±12 190.4）mIU/mL，CV为3.93%。该检测结果与本实验室采用最佳稀释比例（1∶200）得出的检测结果比较，差异无统计学意义（t=-0.811，P=0.422）。

2.3 222份超高值样本原倍血清的RLU值范围及其所选择的对应稀释比例汇总

对222份hCG超高值样本原倍血清的RLU值范围及其可选择的对应稀释比例进行汇总，结果显示，在实际应用中，只需按照超高值样本原倍血清的初始RLU值，根据表2中给出的RLU值所对应的3～4个备选稀释比例分别进行检测，可快速、准确地挑选出最佳稀释比例。

表2 222份超高值样本原倍血清的RLU值范围及其可选择的对应稀释比例汇总

3 讨论

肿瘤标志物超高值样本的规范化检测直接影响其临床指导意义，最佳稀释比例的科学求取方法能促进此类检测结果的实验室间互认。超高值样本检测结果的互认需要一个可供比较的平台，若各平台之间缺少公认的稀释参照点，自由选择稀释比例，那么得出的结果必然重复性较差，无可比性。本研究结果显示，对同一份hCG超高值样本采用不同稀释比例进行稀释检测，其极差为150 700.2 mIU/mL，已远远超出临床可接受范围。以定标曲线高值定标点RLU值为稀释参照点，选择稀释后RLU值最接近高值定标点RLU值所对应的稀释比例为最佳稀释比例，由最佳稀释比例换算的测定值最具有可比性。虽然已有多个学者探讨过最佳稀释比例问题，但均未涉及稀释参照点的选择[6-7]。如果不涉及稀释参照点，随着样本被测物浓度的进一步提升，最佳稀释比例也将增大，可能就不止1∶100这1个稀释比例[6]。因此，首选1∶100作为最佳稀释比例的临床应用价值是有限的。

综上所述，结合试剂定标曲线高值定标点参数RLU值去选择最佳稀释倍数具有广泛的应用价值，不但解决了正反应曲线（如肿瘤标志物检测项目）的超线性范围样本的精准检测问题，还为反曲线（倒S形）检测项目（如甲状腺激素）超线性检测提供了可行的方法。