FRA-2 mRNA 表达及DNA 甲基化水平与代谢综合征的相关性研究

杜晴晴，侯泽鑫，李 军，胡 颖，曹国磊，李思源

1.石河子大学医学院，石河子 832002；2.石河子大学医学院第一附属医院内分泌代谢科，石河子 832002；3.新疆医科大学第四附属医院神志科，乌鲁木齐 830099；4.新疆医科大学附属肿瘤医院呼吸神经内科，乌鲁木齐 830011

近年来，西方生活方式在全球范围内日益流行，代谢综合征（metabolic syndrome，MS）的患病率也随之上升，其在一些发展中国家城市人口中的患病率往往高于发达国家，已成为一个全球性的威胁健康的重要问题。MS 是肥胖或超重、高血糖、胰岛素抵抗等多种代谢异常构成的复杂的代谢异常症候群。MS促进冠状动脉粥样硬化性心脏病、卒中及恶性肿瘤等疾病的发生，这些疾病造成的医疗保健成本和潜在的经济活动损失成本，数以万亿计［1-2］。

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式。有研究［3］发现，DNA 甲基化可能通过在启动子区域的CpG 序列添加甲基来发挥作用，参与哺乳动物发育、代谢、稳态调节及肥胖和多种疾病的发生。DNA甲基化也可能与MS的发生有关［4］。Fos相关抗原-2（Fosrelated antigen-2，FRA-2）属于转录因子激活蛋白1（activator protein-1，AP-1）家族，存在于动物的多种组织和细胞，参与细胞增殖、分化等过程；FRA-2的异常表达可导致疾病的发生和发展［5］。FRA-2参与哺乳动物能量平衡、糖脂代谢及胰岛素抵抗的调节，与MS、糖尿病、动脉粥样硬化等的发生有关［6-9］。到目前为止，FRA-2mRNA及DNA甲基化水平与MS的相关关系尚不清楚。本研究拟探讨FRA-2mRNA及DNA甲基化水平与MS的关系，探究MS发生的分子机制以寻找MS防治的潜在靶点。

1 对象和方法

1.1 研究对象

选取2020年6月—2021年6月石河子大学医学院第一附属医院内分泌代谢科就诊的患者，根据《中国2 型糖尿病防治指南（2020 年版）》［10］对MS 的定义，将有MS 危险因素（高血糖、高血脂、高血压、肥胖）≥3 项的患者纳入MS 组（n=80），有MS 危险因素1～2 项的患者纳入非MS 组（n=80）。MS 的诊断标准满足以下≥3 项：①腰围（waist circumference，WC）女性≥85 cm，男性≥90 cm。②确诊高血压，或收缩压（systolic blood pressure，SBP） ≥130 mmHg或舒张压（diastolic blood pressure，DBP）≥85 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。③高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）＜1.04 mmol/L。④三酰甘油（triacylglycerol，TAG） ≥1.7 mmol/L。⑤确诊2 型糖尿病或空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）≥6.1 mmol/L。另外选取同期的健康体检者纳入对照组（无MS 危险因素，n=80）。各组排除具有以下情况人群：①各种严重肝、肾、心血管疾病者。②长期服用激素、免疫抑制剂者。③近期有外伤或手术者。④妊娠及哺乳期者。收集患者年龄、性别、体质量指数（body mass index，BMⅠ）等资料。本研究经石河子大学医学院第一附属医院医学伦理委员会批准（伦理审查号：KJ2020-142-01），所有参与的患者均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集及生化检测 所有研究对象均禁食12～14 h，晨起空腹抽取静脉血2 管，每管约2 mL。一管为EDTA 抗凝管，备以后续DNA 及RNA 提取；另一管为真空采血管，经过混匀后9 000×g离心10 min，离心管收集上清液备用，然后均置于-80 ℃冰箱中冻存。使用全自动生化分析仪（AU5800，美国贝克曼公司）测定FPG、TAG、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol， LDL-C）、HDL-C，使用全自动电化学发光免疫分析仪（COBAS e 601，德国罗氏） 测定空腹胰岛素（fasting serum insulin，FⅠNS）。使用稳态模型评估法来计算胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-ⅠR），公式为HOMA-ⅠR=FⅠNS×FPG/22.5。

1.2.2 RT-PCR 方法检测FRA-2mRNA 表达 TRⅠzol法提取RNA，后按照cDNA 第一链合成试剂盒（美国APExBⅠO 公司） 说明书合成cDNA 模板，进行PCR 扩增。反应条件为：94 ℃4 min，72 ℃2 min，然后94℃20 s、56 ℃30 s、72 ℃60 s，进行35 个循环。加入1 对内参（β-actin）的特异性引物，同时扩增内参DNA（引物序列见表1）。使用GelDoc EZ 全自动凝胶成像分析系统（美国UVB公司）和2-ΔΔCT法分析FRA-2mRNA相对表达水平。

1.2.3 MALDⅠ-TOF-MS法检测FRA-2DNA 甲基化水平 取200 μL血液样本，提取DNA，使用NanoDrop分光光度仪定量检测基因组DNA 的浓度及纯度，以保证其DNA 浓度＞50 ng/μL，纯度［D（260 nm）/D（280 nm）］位于1.7～2.0 之间。依据EZ DNA 甲基化修饰处理试剂盒（D5001，美国Sequenom 公司）以及美国Sequenom 公司推荐的方式对基因组DNA 进行亚硫酸氢盐修饰，反应条件为：95 ℃30 s，50 ℃15 min，进行20 个循环。PCR 扩增DNA，反应条件如下：94 ℃预热4 min，72 ℃退火3 min，接下来45个循环（94 ℃20 s，56 ℃30 s，72 ℃1 min）。PCR产物在384-pad光谱芯片（美国Sequenom公司）上测定。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列Tab 1 Primer sequences for PCR

使用MassARRAY 质谱仪（美国SEQUENOM公司）收集质谱图，使用EpiTYPER v1.0.5 软件生成各CpG 单元的甲基化数据。经由对比甲基化峰与非甲基化峰的强度来计算所检测基因各CpG 单元相对的甲基化率。共检测了10 个CpG 单元，分别为CpG 1、CpG 3、CpG 4.5、CpG 6.7、CpG 8、CpG 9.10、CpG 11、CpG 12.13.14、CpG 15.16.17、CpG 19。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件进行数据分析。符合正态分布的定量资料以±s表示，方差分析示3 组间年龄差异有统计学意义，余资料采用协方差分析以校正年龄对组间临床指标的影响；非正态分布定量资料以M（Q1，Q3）表示，采用Kruskal-WallisH检验；每增加1个危险因素，FRA-2DNA甲基化水平变化量采用线性回归分析；指标间相关关系采用Spearman 相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组间一般资料比较

Kruskal-WallisH检验显示，MS 组年龄高于对照组及非MS 组（P＜0.05）。使用协方差分析校正年龄对组间临床指标的影响后，发现MS 组BMⅠ、WC、DBP、SBP、FPG、TAG、TC、LDL-C、HOMA-ⅠR均高于对照组及非MS 组（P＜0.05），HDL-C 低于对照组及非MS组（P＜0.05）。结果见表2。

表2 3组间一般及临床资料比较Tab 2 Comparison of general and clinical data among the three groups

2.2 组间FRA-2 mRNA表达水平比较

与对照组及非MS 组相比，MS 组FRA-2mRNA表达水平降低（均P=0.000）（图1）。

图1 3组间FRA-2 mRNA相对表达水平比较Fig 1 Comparison of relative expression levels of FRA-2 mRNA among the three groups

2.3 组间FRA-2 DNA甲基化水平比较

协方差分析结果（表3、图2）显示：与对照组相比，非MS 组及MS 组CpG 1（P=0.014，P=0.016）、CpG 3 （P=0.006，P=0.000）、CpG 12.13.14 （均P=0.000）、CpG 19（均P=0.000）甲基化水平上升；与非MS 组相比，MS 组CpG 4.5、CpG 6.7、CpG 8、CpG 9.10、CpG 15.16.17甲基化水平上升（均P=0.000）。

图2 FRA-2 DNA甲基化水平聚类分层Fig 2 FRA-2 DNA methylation level clustering stratification

表3 各CpG单元DNA甲基化水平比较Tab 3 Comparison of DNA methylation levels in each CpG unit

2.4 FRA-2 DNA 甲基化水平与MS 危险因素个数的关系

以FRA-2DNA 甲基化水平（10 个CpG 单元的平均甲基化率）为因变量，以MS 的危险因素个数为自变量进行线性回归分析。结果（图3）显示，MS 危险因素个数与FRA-2DNA 甲基化水平呈正相关（β=0.012，P=0.000），即危险因素每增加1 个，FRA-2DNA甲基化水平上升0.012%。

图3 FRA-2 DNA甲基化水平与MS危险因素个数的关系Fig 3 Relationship between FRA-2 DNA methylation level and the number of MS risk factors

2.5 FRA-2 DNA 甲基化水平与MS 危险因素的相关性分析

Spearman 相关分析结果（表4）显示，CpG 3、CpG 4.5、 CpG 6.7、 CpG 8、 CpG 9.10、 CpG 12.13.14、CpG 19 甲基化水平均与WC、SBP、DBP、FPG、TAG 呈正相关；CpG 1 和CpG 15.16.17 甲基化水平与WC、DBP、TAG 呈正相关；CpG 1、CpG 3、CpG 4.5、CpG 8、CpG 9.10、CpG 12.13.14、CpG 19甲基化水平与HDL-C呈负相关（均P＜0.05）。

表4 FRA-2 DNA甲基化水平与MS危险因素的相关性分析Tab 4 Correlation analysis between FRA-2 DNA methylation level and MS risk factors

2.6 FRA-2 DNA甲基化水平与mRNA表达的相关性分析

Spearman相关分析的结果（图4）所示，FRA-2DNA甲基化水平（10个CpG单元的平均甲基化率）与FRA-2mRNA表达水平呈负相关（r=-0.607，P=0.000）。

图4 FRA-2 DNA甲基化水平与mRNA表达水平的相关性Fig 4 Correlation between FRA-2 DNA methylation level and mRNA expression level

3 讨论

DNA 甲基化是一种重要的修饰方式，可以调控基因表达，在不改变分子一级结构的前提下发挥重要的生物学作用，其与高血糖、高血压等心血管疾病的危险因素增多有关［11］。既往研究［12］发现，FRA-2蛋白参与了糖脂代谢紊乱及MS 的发生。目前关于FRA-2mRNA及DNA甲基化表达水平与MS相关性的报道较少。

赵天明等［13］通过流行病学分析发现，随年龄的增加MS 的患病率上升。本研究结果显示，与对照组及非MS 组相比，MS 组年龄更高；可能是由于随着年龄增加，机体器官功能有所减退，MS 危险因素的成分增加，患病概率增大。CHⅠURAZZⅠ等［14］研究显示，MS 人群表现为中心性肥胖、高血压、高血糖、高血脂及胰岛素抵抗的特征，与对照组及非MS组比较，MS 组WC、DBP、SBP、FPG、TAG、TC、LDL-C、HOMA-ⅠR 上升，HDL-C 降低；我们的研究数据与该研究相似。

通过RT-PCR 对研究对象FRA-2mRNA 进行检测发现，MS 组FRA-2mRNA 表达水平显著低于对照组及非MS 组，提示MS 的发生发展可能与FRA-2mRNA 表达下调有关。SAMBLAS 等［4］的研究发现，甲基化参与肥胖人群代谢及循环紊乱，缺氧诱导因子3A（hypoxia inducible factor 3A，HIF3A）、胰岛素样生长因子结合蛋白3 （insulin-like growth factor binding protein-3，IGFBP-3）、固醇调节元件结合转录因子1 （sterol regulatory element binding factor 1，SREBF1）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、 昼夜节律钟（clock circadian regulator，CLOCK）等基因的甲基化水平可作为预测和评估MS的重要标志。我们进一步用MALDⅠ-TOF-MS 对外周血中FRA-2DNA甲基化水平进行检测。结果表明，与对照组相比，MS 组多个CpG 单元甲基化水平上升，可以推测在MS发生中，FRA-2DNA 高甲基化可能起到重要作用。相关分析结果显示，FRA-2基因9 个CpG 单元甲基化水平与WC、DBP、TAG 呈正相关，7 个CpG 单元甲基化水平与SBP 及FPG 呈正相关，7 个CpG 单元甲基化水平与HDL-C 呈负相关；推测FRA-2可能通过DNA 高甲基化的形式参与血糖、血脂、血压等的调节，进而参与MS 发生发展的过程。既往研究［15］发现，FRA-2与糖尿病患者的FPG、TG的调节有关；本研究结果与之相似。

此外，本研究还发现，FRA-2DNA高甲基水平与MS 人群SBP 及DBP 升高之间存在相关性；该结果与以往研究［12］不同，可能与纳入研究对象危险因素个数的差异性或不同的遗传背景有关。近年来，有研究［16-17］报道，DNA甲基化可通过影响肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosteronesystem，RAAS）参与高血压的发生，但FRA-2是否经该通路发挥作用有待进一步研究。全贞玉等［18］认为，MS的发生及严重程度与危险因素个数有关。本研究通过线性分析发现，危险因素每增加1个，FRA-2DNA甲基化水平上升0.012%，提示MS 患者FRA-2基因甲基化程度可能受危险因素个数的影响。XⅠE 等［19］研究发现，外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中，DNA 甲基化水平对mRNA 表达有调节作用，DNA可通过高甲基化的方式下调mRNA的表达，从而参与疾病的发生。本研究发现FRA-2DNA甲基化水平与mRNA表达呈负相关，提示FRA-2基因在MS 中可能具有相似的致病机制，但其具体的分子机制及信号通路，还需要进一步探索。

综上所述，本研究发现FRA-2基因甲基化水平与MS发生具有一定的相关性，DNA 甲基化水平增高从而下调mRNA 表达可能在MS 发生中发挥作用。未来需要设计更大样本量的多中心研究及前瞻性研究，以明确FRA-2与MS 发生的因果关系及FRA-2参与MS发生的机制。