神经生长因子与被动运动对失神经大鼠骨代谢指标的影响

王枫 赵立奇 姬宇辉 蒋维海 张佳月

[摘要]目的探究神經生长因子与被动运动对失神经大鼠骨代谢指标的影响。方法采用随机抽签法将60只大鼠随机分为假手术组（SHAM组）、去神经组（DN组）、神经生长因子组（NGF组）、被动运动组（PM组）、神经生长因子及被动运动联合组（NGF+PM组）共5组，SHAM组无需将坐骨神经及股神经切除，其他4组将大鼠右侧坐骨神经及股神经切除，建立SD大鼠右侧后肢去神经模型，给予被动运动及外源生长因子干预，比较各组大鼠血清骨钙素（BGP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）水平。结果术后2周大鼠体重均有所增加，术后3周DN组、NGF+PM组、SHAM组体重均明显高于PM组与NGF组，术后4周DN组最轻，SHAM组最重，差异有统计学意义（P<0.05）;DN组大鼠血清BGP明显低于SHAM组，血清TRACP水平高于SHAM组，差异有统计学意义（P<0.05）;NGF组、NGF+PM组血清BGP水平高于DN组，血清TRACP 水平低于DN组，差异有统计学意义（P<0.05）;PM组血清TRACP水平明显低于DN组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论大鼠下肢丧失神经支配后会出现肌肉萎缩及骨代谢破坏，给予神经生长因子及被动运动干预，有利于改善血清BGP与TRACP水平，预防骨质疏松的发生。

[关键词]大鼠;神经生长因子;被动运动;骨代谢指标;血清骨钙素;血清抗酒石酸酸性磷酸酶

[中图分类号]R580    [文献标识码]A    [文章编号]2095-0616（2022）01-0035-04

Effects of nerve growth factor and passive movement on bone metabolic indexes in denervated rats

WANG Feng    ZHAO Liqi    JI Yuhui    JIANG Weihai    ZHANG Jiayue

Department of Orthopedics，Shenzhen Samii Medical Center，Guangdong，Shenzhen 518118，China

[Abstract]Objective To investigate the effects of nerve growth factor （NGF）and passive movement （PM）on bone metabolic indexes in denervated （DN）rats. Methods A total of 60 rats were randomly divided into 5 groups，the sham-operated group （SHAM group），the DN group，the NGF group，the PM group，and the combined NGF and PM group （NGF+PM group）. The rats in the SHAM group were not required to remove the sciatic nerve and femoral nerve，while rats in the other 4 groups underwent the removal of the right sciatic nerve and femoral nerve to establish the right hindlimb DN model of SD rats，which were intervened with PM and exogenous growth factors. The levels of serum osteocalcin （BGP）and tartrate-resistant acid phosphatase （TRACP）were compared among these groups. Results The body weight of the rats increased at 2 weeks after the operation，and the body weight of the DN group，NGF+PM group，and SHAM group was significantly higher than that of PM group and NGF group at 3 weeks after operation;4 weeks after the operation，the DN group was the lightest and the SHAM group was the heaviest，and the differences were statistically significant （P<0.05）;The serum BGP level of rats in the DN group was significantly lower than that in the SHAM group，and the serum TRACP level was higher than that in the SHAM group，with statistically significant differences （P<0.05）. The serum BGP level in the NGF group and NGF+PM group were higher than that in DN group，and the level of serum TRACP were lower than that in the DN group，with statistically significant differences（P<0.05）. The serum TRACP level in the PM group was significantly lower than that in the DN group，with statistically significant differences （P<0.05）. Conclusion The denervation in the lower limbs of rats will lead to muscle atrophy and destruction of the balance of bone metabolism，and the intervention of NGF and PM is helpful to improve the serum BGP and TRACP levels and prevent the occurrence of osteoporosis.

[Key words]Rats;Nerve growth factor;Passive movement;Bone metabolism indexes;Serum BGP;Serum TRACP

作为临床常见的骨科疾病，废用性骨质疏松主要指肢体运动功能障碍或受限导致骨量减少进而产生的骨质疏松，与长时间缺乏运动锻炼密切相关。尤其是处于瘫痪卧床、肢体活动功能受限的情况下，患者饮食量减少，营养物质摄入不足，更易引起废用性骨质疏松[1]。目前，临床对于废用性骨质疏松尚无特效疗法，主要采用电刺激及脉冲电磁场治疗，有一定限制，且无法直接对瘫痪部位产生作用。最新研究发现，神经生长因子对成骨细胞活性具有一定的强化作用[2]。基于此，本研究构建废用性骨质疏松大鼠模型，给予神经生长因子及被动运动干预，研究结果报道如下。

1    材料与方法

1.1    材料

本研究所用的60只普通级雄性SD大鼠均由上海甲干生物科技有限公司提供[生产许可SCXK（沪）2020-0006]，大鼠月龄2个月，重量150～210 g，平均（181.28±10.32）g，随机分为5组，每组各12只。采用标准类啮齿类动物饲料对所有大鼠进行喂养。本研究所用鼠神经生长因子购自舒泰神（北京）药业有限公司，国药准字S20060023。动物饲养、造模取材及各项检测器材均购自南京英瀚斯生物科技有限公司。

1.2    方法

1.2.1    动物分组    所有实验大鼠均进行1周适应性喂养，随机分为5组，每组各12只。干预组包括去神经组（DN组）、神经生长因子组（NGF组）、被动运动组（PM组）、神经生长因子与被动运动联合组（NGF+PM组），均将右侧坐骨神经及股神经切除。假手术组（SHAM组）无需将神经切除，其余手术方法与干预组相同。

1.2.2    造模    严格按照国家动物实验处置标准进行造模。所有大鼠按照30 mg/kg的剂量给予戊巴比妥钠（上海上药新亚药业有限公司，国药准字H31021725，规格：0.1g）腹腔麻醉，手术位置进行脱毛及消毒处理，妥善固定四肢，将大鼠摆为俯卧位，由右侧大腿后外股中部行一纵向切口，使股二头肌充分暴露，对肌肉实施钝性分离，对坐骨神经进行充分游离，切开长度以5 mm为宜，对伤口予以缝合。将大鼠调整为仰卧位，妥善固定，于腹股沟正中行一切口，使肌肉充分暴露，钝性分离肌间，股神经的切除应在腹股沟韧带下进行，切口长度为5 mm，对切口予以冲洗后常规缝合。术后给予抗生素治疗，时间为3 d，预防感染。

1.2.3    干预方法    PM组：采用多关节主被动训练仪XY-ZBD-IB（上海涵飞医疗器械有限公司），设定好节奏，对大鼠患肢实施多关节幅度屈伸运动，训练频率以600来回/d为宜。NGF组：将外源性神经生长因子注射液[舒泰神（北京）药业有限公司，国药准字S20060023，规格：30 jig（15 000 U）/瓶]按照2 U/（kg·d）的剂量注射于大鼠右侧腓肠肌。NGF+PM组：实施神经生长因子与被动运动联合干预，操作方法与PM组、NGF组相同。DN组：给予同等体积生理盐水注射。SHAM组：不予任何干预措施。1.2.4&nbsp;   取材与指标检测    干预1个月，采用股动脉放血法对大鼠进行处死处理，按照预先编订的真空采血管对股动脉血进行采集，在室温状态下静置1 h，然后按照3000 r/min的离心速率进行离心处理，时间为10 min，然后分离血清。采用GC-1200型γ放射免疫计数器（上海原子核所日环光电仪器有限公司）对血清BGP指标予以测定，测定方法为放射免疫法，相关试剂盒购自上海信帆生物科技有限公司。血清抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）指标采用迈瑞BS-200全自动生化分析仪（上海同舸医疗器械有限公司）。

1.3    观察指标

观察大鼠一般情况并记录5组大鼠在实验前及术后1、2、3、4周的体重变化情况，对比5组大鼠血清骨钙素（BGP）、TRACP指标差异。

1.4    统计学方法

2    结果

2.1    大鼠一般情況分析

术后2 d大鼠活动出现减慢趋势，神情倦怠，进食量明显减少，部分大鼠切口位置有血肿。SHAM组大鼠能够自由、灵活活动，无右后腿萎缩。DN组大鼠生长速度较其他组延缓，毛色光泽降低，有稀疏、蓬松感，活动能力降低，神情倦怠。NGF组、PM组及NGF+PM组体征与SHAM组类似，身体增长速度较快。实验期间各组大鼠生长发育基本正常。

2.2    5组大鼠体重变化比较

实验前各组大鼠体重比较，差异无统计学意义（P>0.05）;术后2周体重均有所增加，术后3周DN组、NGF+PM组、SHAM组体重均明显高于PM组与NGF组，差异有统计学意义（P<0.05）;术后4周DN组最轻，SHAM组最重，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.3    5组大鼠血清BGP、TRACP水平比较

DN组大鼠血清BGP明显低于SHAM组，血清TRACP水平高于SHAM组，差异有统计学意义（P<0.05）;NGF组、NGF+PM组血清BGP水平高于DN组，血清TRACP水平低于DN组，差异有统计学意义（P<0.05）;PM组血清TRACP水平明显低于DN组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3    讨论

有文献报道，骨形成细胞在骨折愈合中具有NGF表达，主要表现为成骨细胞可见NGF受体，其与NGF相结合会对成骨细胞活性起到增强作用，提示NGF在骨形成中有一定的参与作用[3-5]。神经支配作用会直接影响骨折愈合的效果，神经缺损状态下，骨折愈合会出现骨痂缺陷。通过NGF干预能够对神经纤维在骨痂生长方面起到引导作用，促进骨折修复效率及修复速度的提升，是促进骨折愈合的有效路径。既往研究发现，人重组骨形态形成蛋白（BMP）可对NGF及其高亲和受体表达进行诱导，提示骨形成过程中NGF能够通过BMP路径发挥相应的作用[6]。目前临床关于NGF治疗骨质疏松方面的研究相对较少，NGF在骨折愈合中的作用机制尚不明确，但通过NGF对骨代谢促进作用的研究可以考虑将NGF用于骨质疏松症治疗，能改善骨质疏松。

长期处于制动或卧床状态时，因缺乏力学方面的刺激，容易引起骨质疏松，严重者会出现脊髓损伤，导致下肢彻底制动，患者股骨颈及胫骨近端骨密度会受到严重的影响，导致骨量丢失严重[7]。有学者认为早期给予脊髓损伤患者适当干预能够对肌肉萎缩症状起到缓解作用，防止牵张力降低、消失，减少骨量的丢失，进而对骨质疏松起到预防作用[8-10]。被动训练则是早期干预最为常见的方法。针对失神经支配患者，加强被动运动可减缓骨量丢失及骨密度降低。在被动运动干预下，机械牵应力增加，有利于骨细胞膜矿化增加，对骨组织生长及重建具有一定的刺激作用。不仅如此，被动运动还有利于骨皮质血流量增加，加快骨组织吸收，使得营养物质被充分吸收[11]。本研究在设计实验时需要借助被动运动使得大鼠下肢关节得以屈伸。作为重要骨代谢生化指标，BGP主要来源于成骨细胞，具有较好的稳定性，能够对异常磷灰石晶体的形成产生抑制作用，使得骨正常矿化速率处于正常水平，生长软骨矿化速率也会受到一定的影响[12-13]。BGP指标能够反映成骨细胞活动状态及活性，具有较高的敏感性。TRACP主要分布于巨噬细胞与破骨细胞，能够反映骨吸收情况及破骨细胞活性[14]。骨吸收得到增强后，骨表面会附着破骨细胞，经过代谢作用会降低TRACP的活性。检测血清TRACP水平能够随时掌握病理状态下的骨吸收情况[15]。本研究结果显示，去神经各组大鼠血清BGP明显低于SHAM组，血清TRACP水平高于SHAM组，差异有统计学意义（P<0.05）。且NGF+PM组血清TRACP水平明显低于DN组。说明被动运动与神经生长因子联合作用可增强成骨能力。但由于样本较少、精力有限，本研究可能存在一定偏差，在后续研究中应加大样本，增加随访指标，从更多方面探究神经生长因子与被动运动的优势及作用机制，为临床提供更多可靠的依据。

综上所述，神经生长因子与被动运动能够对失神经大鼠骨代谢指标起到改善作用，有利于延缓、抑制废用性骨质疏松的发生，应予以关注。

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