柚皮素对牙本质基质金属蛋白酶活性及粘接耐久性的影响

张文浩 叶琦 魏迪欣 庄园 李艳芬

[摘要]目的探讨柚皮素对牙本质基质金属蛋白酶活性及粘接耐久性的影响。方法收集2019年1月至2020年6月就诊于深圳市宝安区妇幼保健院口腔科患者的第三磨牙进行研究，第三磨牙由深圳市宝安区妇幼保健院口腔科提供。将第三磨牙制备成牙本质试件及牙本质粉，随机分为去离子水处理组（空白对照组）、柚皮素处理组、氯己定处理组。各组分别处理10 mm，將牙本质胶原样本分别置于老化液中15 d，检测柚皮素对胶原干重、羟脯氨酸释放量、MMPs活性的影响。制作牙本质剪切力测试试件，分别用柚皮素、氯己定、去离子水处理后，检测不同组的抗剪切强度。结果柚皮素和氯己定处理后的牙本质胶原的干重丢失比例低于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;而柚皮素组与氯己定组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。柚皮素组和氯己定组中羟脯氨酸释放量低于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;而柚皮素组与氯己定组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。柚皮素组及氯己定组的MMPs总活性均低于空白对照组，经氯己定和去离子水处理的活性值比较，差异有统计学意义（P<0.05）。柚皮素和氯己定处理后的最大抗剪切强度高于空白组，差异有统计学意义（P<0.05）;且柚皮素处理后的最大抗剪切强度显著高于氯己定组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论柚皮素能够抑制基质金属蛋白酶活性，减少胶原纤维的降解，稳定胶原纤维，从而提高牙本质粘接耐久性。

[关键词]柚皮素;基质金属蛋白酶活性;粘接耐久性;抗剪切强度

[中图分类号]R783.1    [文献标识码]A    [文章编号]2095-0616（2022）01-0031-04

Effect of naringenin on matrix metalloproteinase activity and bonding durability of dentin

ZHANG Wenhao    YE Qi    WEI Dixin    ZHUANG Yuan    LI Yanfen

Department of Stomatology，Shenzhen Baoan Maternal and Child Health-Care Hospital，Guangdong，Shenzhen，518101，China

[Abstract]Objective To investigate the effect of naringenin on the activity of matrix metalloproteinase and the bonding durability of dentin. Methods The third molars of patients who visited the Department of Stomatology in Shenzhen Baoan Maternal and Child Health-Care Hospital from January 2019 to June 2020 were collected and studied. The third molars were provided by the Department of Stomatology in this hospital. The third molars were prepared into dentin samples and dentin powder，which were randomly divided into deionized water treatment group （blank control group），naringenin treatment group and chlorhexidine treatment group. Each group was treated for 10 minutes，and the dentin collagen samples were placed in aging solution for 15 days. The effects of naringenin on dry weight of collagen，hydroxyproline release and MMPs activity were detected. The test specimens were made for dentin shear and treated with naringenin，chlorhexidine and deionized water，respectively，and then the shear strength of different groups was tested. Results The dry weight loss ratio of dentin collagen treated with naringenin and chlorhexidine was lower than that of the blank group，with statistically significant difference （P<0.05）. However，there was no significant difference between naringenin group and chlorhexidine group （P>0.05）. The release of hydroxyproline in naringenin group and chlorhexidine group was lower than that in blank control group，with statistically significant difference （P<0.05）. However，there was no significant difference between naringenin group and chlorhexidine group （P>0.05）. The total activity of MMPs in naringenin group and chlorhexidine group was lower than that in blank control group，with statistically significant difference （P<0.05）. The maximum shear strength of naringenin and chlorhexidine group was higher than that of the blank group，with statistically significant difference （P<0.05）. The maximum shear strength after treatment of naringenin was significantly higher than that of chlorhexidine group，with statistically significant difference （P<0.05）. Conclusion Naringenin can inhibit the activity of matrix metalloproteinases，reduce the degradation of collagen fibers and stabilize collagen fibers，thus improving the durability of dentin bonding.

[Key words] Naringenin;Matrix metalloproteinase activity;Bonding durability;Shear strength

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一組能够分解细胞外基质的钙锌离子依赖型蛋白酶总称，其在肿瘤转移中发挥着重要的作用，是目前被广泛研究的胶原酶之一。牙本质粘接主要是通过酸蚀剂或自酸蚀粘接的处理剂，使粘接界面牙本质脱矿，胶原纤维暴露，随后亲水性树脂粘接剂渗入胶原纤维网，形成微机械扣锁作用，连接牙本质和树脂。然而目前牙本质粘接剂的单体均无法完全渗入至胶原纤维底部，而牙本质粘接剂的酸性环境又能够将MMP酶原激活，从而分解暴露的胶原纤维，对粘接界面产生破坏，导致粘接失败，降低牙本质粘接耐久性。因此抑制MMPs的活性能够有效的增加牙本质粘接耐久性[1]。研究显示，使用柑橘黄烷酮类物质能够改善牙本质粘接稳定性，提高牙本质粘接耐久性[2]。柚皮素具有抗炎、抗氧化等多种生物活性，但目前临床上鲜有柚皮素是否可以抑制胶原酶活性的相关报道。因此，本研究分析了柚皮素对牙本质MMPs酶活性及粘接耐久性的影响。

1    材料与方法

1.1    材料和仪器

柚皮素（Sigma，美国）;MMPs活性比色法检测试剂盒（上海杰美基因）;明胶酶/胶原酶试剂盒（In-vitrogen，美国）;羟脯氨酸试剂（南京建成生物科技公司）;微量加样器（Eppendof，德国）;多功能酶标仪（Molecular Devices，美国）;慢速金刚石切割机（Buehler，美国）;分析天平（Mettler Toledo，瑞士）;恒温水浴箱（Shellab，美国）;万能材料测试仪（Shimadzu，日本）。

1.2    方法

1.2.1    牙本质的胶原样本制备    收集2019年1月至2020年6月就诊于深圳市宝安区妇幼保健院口腔科患者36颗第三磨牙进行研究，第三磨牙由深圳市宝安区妇幼保健院口腔科提供。将牙齿表面的污垢和软组织进行清除，流水冲洗后去除咬合面釉质，充分暴露冠中部牙本质，制备成牙本质试件，尺寸为7 mm×1.7 mm×0.7 mm，共24个;用100 g/L的HPO进行脱矿，时间为24 h，流水冲洗，检测牙本质试件的完全脱矿情况。

1.2.2    牙本质的胶原干重检测    将牙本质胶原样本置于离心管中，于真空干燥箱中脱水24 h，达至恒重后对样本进行称重并记录，再浸于去离子水中，随机分组为空白组（n=12）：将牙本质胶原样本放置在去离子水中约10 min;柚皮素组（n=12）：将牙本质胶原样本放置在500 μg/ml柚皮素中处理约10 min;氯己定组（n=12）：将牙本质胶原样本放置在2 g/L的氯己定液中处理约10 min。将各组牙本质胶原样本放置在含有1 ml老化液的离心管中，于37℃的恒温水浴箱中进行老化，15 d后进行再次离心称重。

1.2.3    羟脯氨酸释放量检测    将老化15 d的牙本质胶原样本取出，将离心管置于离心机中进行离心，转速为3000 rpm，时间为30 min;离心完成后收集上清液，利用酶标仪检测羟脯氨酸的含量，波长设置为550 nm，每个样本检测3次，计算牙本质胶原的羟脯氨酸释放量。

1.2.4    基质金属蛋白酶的提取    3种处理组样本在液氮下碾磨成牙本质粉，分别将1 g牙本质粉加入至10 ml 10%的磷酸中，置于4℃冰箱中进行脱矿，时间为8 h，再置于超低温离心机中进行离心，转速为3000 rpm，时间为2 min，弃掉酸蚀液，用5 ml 100mM Tris-HCl对离心管中剩余的牙本质粉进行冲洗，再置于离心机中进行离心，弃掉上清液，重复以上操作3次，加入5 ml十二烷基硫酸钠溶液，放置在离心机中离心，转速为14 000 rpm，时间为10 min，提取的上清液为基质金属蛋白酶。

1.2.5    酶活性检测    用MMPs活性比色法检测试剂盒检测牙本质提取液中的每10 μg总蛋白中的MMPs总活性。

1.2.6    剪切试验    环氧树脂包埋离体牙，去除牙釉质，暴露冠中部牙本质。用600目的砂纸湿润下打磨成平面。粘接面的处理分别是：柚皮素组用500 μg/ml的柚皮素中处理约1 min;氯己定组用2 g/L的氯己定中处理1 min;空白对照组用去离子水处理1 min。然后按照标准树脂粘接、充填流程，完成样本与复合树脂的粘接。将试件浸泡于37℃蒸馏水中，放置24 h。以0.5 mm/min进行加载，记录界面断裂时的最大剪切力。抗剪切强度（MPa）=最大剪切力值（N）/试件粘结面积（mm）。

1.3    观察指标

记录柚皮素对胶原干重、羟脯氨酸释放量、MMPs活性及抗剪切强度的影响。

1.4    统计学处理

2    结果

2.1    不同处理组的牙本质胶原干重丢失比较

柚皮素组干重丢失比例为[1（8.33%）]，氯己定组干重丢失比例为[1（8.33%）]，空白组干重丢失比例为[6（50.00%）]。柚皮素和氯己定处理后的牙本质胶原的干重丢失比例低于空白组，差异有统计学意义（χ=5.040，P=0.025;χ=5.040，P=0.025）;而柚皮素组与氯己定组比较，差异无统计学意义（χ=0.000，P=1.000）。

2.2    不同处理组牙本质胶原羟脯氨酸释放量比较

空白组羟脯氨酸释放量为（11.51±1.36）μg、柚皮素组羟脯氨酸释放量为（5.51±0.49）μg、氯己定组羟脯氨酸释放量为（6.77±0.77）μg，差异有统计学意义（F=0.151，P=0.005）。

2.3    不同处理组的牙本质粉MMPs总活性比较

经柚皮素处理的MMPs总活性值是（0.87±0.01）pmoles/（min·mg）;经氯己定和去离子水处理的MMPs总活性值分别是（1.05±0.04）和（1.67±0.13）pmoles/（min·mg），差异有统计学意义（F=7.091，P=0.000）。

2.4    不同处理组的抗剪切强度比较

柚皮素处理组获得最大抗剪切强度为（22.91±3.53）MPa，氯己定处理组获得最大抗剪切强度为（17.26±3.18）MPa，去离子水处理组获得最大抗剪切强度为（11.51±1.04）MPa，差异有统计学意义（F=3.923，P=0.000）。见表1。

3    讨论

MMPs是一种牙本质中常见的内源性蛋白酶。大量研究证实，MMPs参与许多疾病的生理过程和病理过程，常见的口腔疾病为牙周病及牙本质龋等[3-4]。人牙本质中通常含有多种MMPs，牙本质经过矿化后，MMPs以酶原形式包裹在牙本质的基质中[5]。在粘接时使用的酸蚀剂和粘结剂中的酸性单体均能够分泌出酸性物质，降低口腔内环境的pH值，激活内源性MMPs，以达到降解胶原的效果[6-9]。胶原酶抑制剂通过抑制MMPs活性可提高牙本质的粘结持久性[10-12]。目前常用的胶原酶抑制剂有原花青素及柚皮素，原花青素有助于改善牙本质的粘结持久性，但由于颜色较深，会使牙齿着色，因此在应用中受到限制[13-15]。柚皮素的颜色与人牙齿颜色相近，可有效避免牙齿着色问题[16-17]。柚皮素具有抗菌、抗炎、抗衰老及类雌激素等多种药理活性，其可通过抑制MMPs活性提高了牙本质的粘接持久性[18]。

本研究结果显示，柚皮素处理后的牙本质胶原的干重丢失比例、羟脯氨酸释放量低于氯己定和空白对照组（P<0.05），柚皮素组的MMPs总活性均低于氯己定组、空白对照组（P<0.05）。柚皮素处理后的最大抗剪切强度显著高于氯己定组、空白对照组（P<0.05）。分析原因可能为：①柚皮素分子结构中的苯环上的羟基等与胶原酶催化区域中的羧基发生化学反应后，改变胶原酶催化区域的空间结构，区域被外源性酶切断后，MMPs酶原被激活，從而抑制MMPs活性[19-20]。②柚皮素的酚羟基及苯环可能与胶原分子上的酶切割位点发生疏水及氢键作用，改变了胶原和酶结合区域的空间构象，导致该位点不容易被胶原酶识别与结合，胶原耐酶解性能增强，从而保护了胶原[21-22]。③柚皮素通过抑制牙本质中MMPs活性，且柚皮素能够抑制牙髓细胞中的MMPs活性，通过双重效果来提高牙本质的粘接效果，提高牙本质粘接即刻的微拉伸强度，有利于改善牙本质的粘接耐久性[23]。

综上所述，柚皮素可通过抑制牙本质的MMPs活性，保护胶原纤维稳定，增加牙本质的抗剪切强度以改善牙本质的粘接耐久性。

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