鸡内金酶解物制备工艺优化及抗氧化活性研究

张慧莹 杨为乔 陈 瑶 黎 攀,2 杜 冰,2

(1. 华南农业大学食品学院，广东 广州 510642；2. 岭南现代农业科学与技术广东省实验室，广东 广州 510642)

鸡内金为雉科动物家鸡(Gallus gallus domesticus Brisson)的干燥沙囊内壁，始载于《神农本草经》，表述为上品丹雄鸡项下[1]，于2002年被国家卫生计生委收录于“既是食品又是药品的物品名单”的药食同源名单中[2]，具有降血脂[3-4]、保护心脏[5]、健胃消食[6]、增强肠道屏障功能[7]等功效。近年来，有关生物酶解制取多肽的研究越来越多，其效率高、污染低，而且酶解产物包含许多人体必需氨基酸。另一方面，通过酶解可以得到具有抗氧化活性、缓解疲劳和降血压等功能性的更利于人体吸收的小分子多肽[8-9]。但目前有关鸡内金酶解及酶解产物的研究较少[10]。研究拟利用中性蛋白酶及碱性蛋白酶对鸡内金进行酶解，探究鸡内金的最佳酶解工艺和酶解物的相对分子质量分布、氨基酸组成和抗氧化活性，以期为鸡内金的进一步开发利用及鸡内金多肽的分离纯化与功能开发等提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

干鸡内金：市售；

氢氧化钠、五水合硫酸铜、四水合酒石酸钾钠、甲醛、二水合5-磺基水杨酸：分析纯，广州化学试剂厂；

三氯乙酸：分析纯，上海麦克林生化科技有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

杜马斯快速定氮分析仪：rapid N exceed型，德国元素Elementar公司；

全自动氨基酸分析仪：S-433D型，赛卡姆公司；

全自动氨基酸分析仪：日立L-8900型，日立高新技术公司；

笔式酸度计：PHB-3型，上海悦丰仪器仪表有限公司；

磁力搅拌器：85-2WS型，上海沪析实业有限公司；

数显恒温循环水箱：HH-420型，上海力辰邦西仪器科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 鸡内金基本成分分析

(1) 粗多糖含量：按SN/T 4260—2015执行。

(2) 粗脂肪含量：按GB 5009.6—2016执行。

(3) 蛋白质含量：按GB 5009.5—2016执行。

1.2.2 单因素试验 将干燥鸡内金粉碎过60目筛，称取一定量的鸡内金粉末，以中性蛋白酶添加量为0.5%和碱性蛋白酶添加量为1.5%作为单因素试验的基础条件，分别对酶解pH、酶解温度、酶解时间和蒸煮时间进行单因素试验分析，以鸡内金多肽得率及水解度(以干重计)为衡量指标。

(1) 蒸煮时间：固定酶解pH为8，酶解温度50 ℃，酶解时间3 h，100 ℃灭酶10 min，考察蒸煮时间(2，3，4，5，6 h)对酶解上清液水解度和多肽得率的影响。

(2) 酶解pH：固定蒸煮时间4 h，酶解温度50 ℃，酶解时间6 h，100 ℃灭酶10 min，考察酶解pH(7，8，9，10，11)对酶解上清液水解度和多肽得率的影响。

(3) 酶解时间：固定蒸煮时间4 h，酶解pH为8，酶解温度50 ℃，100 ℃灭酶10 min，考察酶解时间(5，6，7，8，9 h)对酶解上清液水解度和多肽得率的影响。

(4) 酶解温度：固定蒸煮时间4 h，酶解pH为8，酶解时间6 h，100 ℃灭酶10 min，考察酶解温度(45，50，55，60，65 ℃)对酶解上清液水解度和多肽得率的影响。

1.2.3 正交试验 根据单因素试验结果，以水解度及多肽得率为衡量指标，选取酶解温度、酶解时间、酶解pH值和蒸煮时间为影响因素，采用L9(34)正交试验进行酶解试验。

1.2.4 水解度测定 参照冯倩等[8]的方法并修改。先测定鸡内金总氮含量；再测定酶解液中游离氨基酸态氮(CN)含量，并按式(1)计算水解度。

DH=CN×V/N×100%，

(1)

式中：

DH——水解度，%；

CN——酶解液中游离氨基酸态氮含量，g/mL；

N——总氮含量，g；

V——酶解液总体积，mL。

1.2.5 多肽含量测定 参照冯倩等[8]的方法。

1.2.6 氨基酸组成分析

(1) 水解氨基酸：参照GB 5009.124—2016并修改。准确称取0.050 0 g鸡内金粉末及0.030 0 g鸡内金酶解物，分别加入10 mL盐酸溶液(6 mol/L)，充入氮气，110 ℃ 电热鼓风恒温箱中水解23 h，过滤，取1 mL滤液，56 ℃水浴蒸干，再加入1 mL一级水，蒸干，重复两次。彻底蒸干后加入4 mL柠檬酸钠缓冲溶液(pH 2.2)，振荡混匀，过0.22 μm滤膜，进样进行氨基酸自动分析仪分析。

(2) 游离氨基酸：准确称取1 g鸡内金粉末，加入3 mL 5%磺基水杨酸研磨30 min，静置2 h，离心，上清液过0.22 μm滤膜，进样进行氨基酸自动分析仪分析。

1.2.7 多肽相对分子质量分布测定 参照朱翰林等[11]的方法。色谱柱为TOSOH TSKgel G2000SWXL凝胶柱，流动相为乙腈—水溶液(V水∶V乙腈=80∶20，内含0.1% 的三氟乙酸)，流速0.5 mL/min，进样量5 μL(质量浓度1 g/L)，检测器为紫外检测器，检测波长220 nm。

1.2.8 多肽抗氧化性测定 按GB/T 39100—2020执行。

1.2.9 数据处理 采用 SPSS 17.0 软件对数据进行统计分析，P<0.05认为具有显著差异。

2 结果与分析

2.1 基本成分

由表1可知，鸡内金营养成分组成绝大部分为蛋白质，其含量(干基)高达97.54%，多糖、脂肪等营养成分含量低，除杂工序简单，且鸡内金作为一种畜产品加工的副产品，具有便宜易得的特点，是一种理想的酶解原料。基于经济效益和时间考虑，采用无需预先进行脱脂、脱糖处理，直接进行酶解的试验方法。

表1 鸡内金的基本成分Table 1 Basic composition of galli gigerii endothelium corneum %

2.2 单因素试验

2.2.1 蒸煮时间对水解度及多肽得率的影响 由图1可知，随着蒸煮时间的延长，鸡内金水解度逐渐增大，鸡内金多肽得率则先增大后趋于平稳。这是因为酶解前进行高温蒸煮会破坏鸡内金的蛋白质结构，使得更多酶作用位点暴露出来，有利于蛋白质肽键的断裂和酶解反应的进行，在一定范围内，适当延长蒸煮时间有利于提高水解度和多肽得率，当水解度和多肽得率达到最大值时，由于底物有限，水解度和多肽得率便不再增加[12]。综合分析，选择蒸煮时间4，5，6 h作为正交试验的3个水平。

小写字母不同表示差异显著(P<0.05)图1 蒸煮时间对水解度及多肽得率的影响Figure 1 Effect of cooking time on degree of hydrolysis and peptide yield

2.2.2 酶解pH对水解度及多肽得率的影响 由图2可知，随着pH值的增大，鸡内金水解度先增加后趋于平稳，多肽得率先增加后降低。当酶解pH值为10时，多肽得率最高为61.27%。多肽得率降低可能是因为在酶解pH值>10时，将大分子蛋白酶解为由3个或3个以上氨基酸组成的多肽的酶在非最适pH值环境下活性减弱[8]。综合考虑，选择酶解pH值为9，10，11作为正交试验的3个水平。

小写字母不同表示差异显著(P<0.05)图2 酶解pH值对水解度及多肽得率的影响Figure 2 Effect of the pH value of enzymatic hydrolysis on degree of hydrolysis and peptide yield

2.2.3 酶解时间对水解度及多肽得率的影响 由图3可知，随着酶解时间的延长，鸡内金水解度先增加后趋于平稳，多肽得率先增加后下降，当酶解时间为8 h时，多肽得率最高。当酶解时间>8 h时，多肽得率开始下降，可能是因为酶解时间过长，多肽被进一步酶解成二肽或少部分的游离氨基酸[13-14]，无法被双缩脲法检测出来。综合考虑，采用酶解时间7，8，9 h作为正交试验的3个水平。

小写字母不同表示差异显著(P<0.05)图3 酶解时间对水解度及多肽得率的影响Figure 3 Effect of enzymatic hydrolysis time on degree of hydrolysis and peptide yield

2.2.4 酶解温度对水解度及多肽得率的影响 由图4可知，随着酶解温度的增加，鸡内金水解度和多肽得率均先增加后降低。当酶解温度为55 ℃时，水解度达到最高为10.67%，当酶解温度为60 ℃时，多肽得率达到最高为55.95%。酶的催化活性受酶解温度影响较大，当鸡内金酶解温度超出其最适反应温度范围，酶活性小，酶解程度低，水解度和多肽得率低[11, 15]。综合考虑，采用酶解温度55，60，65 ℃作为正交试验的3个水平。

小写字母不同表示差异显著(P<0.05)图4 酶解温度对水解度及多肽得率的影响Figure 4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on degree of hydrolysis and peptide yield

2.3 正交试验

在单因素试验基础上，选择酶解温度、酶解时间、酶解pH值和蒸煮时间为影响因素，以多肽得率和水解度为响应值，采用L9(34)正交试验对鸡内金酶解工艺进行优化，正交试验因素水平表见表2，试验设计及结果见表3。

表2 正交试验因素水平表Table 2 The factor level of orthogonal experiment

表3 正交试验设计与结果分析Table 3 Orthogonal experimental design and result analysis

由表3可知，各因素对鸡内金多肽得率影响大小为酶解pH值>酶解时间>蒸煮时间>酶解温度，理论最优鸡内金酶解工艺组合为A2B3C3D3；各因素对鸡内金水解度影响大小为酶解pH值>蒸煮时间>酶解时间>酶解温度，理论最优鸡内金酶解工艺组合为A2B1C3D3及A2B3C3D3。从多肽得率和水解度两方面综合考虑，确定A2B3C3D3为最优鸡内金酶解工艺，即酶解温度60 ℃，酶解时间9 h，酶解pH值11，蒸煮时间6 h。该条件下进行验证实验(n=3)，得到鸡内金多肽得率为75.68%，水解度为14.43%。

2.4 鸡内金及其酶解物氨基酸组成分析

由表4可知，鸡内金酶解后，大部分氨基酸含量略微减少，是因为在碱性条件下进行酶解，除色氨酸外，绝大部分氨基酸都会受到不同程度的破坏。但鸡内金与鸡内金酶解物的17种氨基酸及不同呈味特征氨基酸的占比相差无几，含量最丰富的5种氨基酸均为谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、精氨酸(Arg)、亮氨酸(Leu)和缬氨酸(Val)，与李泽鸿等[16]的结果较为相似，说明碱性蛋白酶与中性蛋白酶共同酶解较好地保留了鸡内金的氨基酸多样性。鸡内金与鸡内金酶解物的必需氨基酸(EAA)与非必需氨基酸(NEAA)的比值(EAA/NEAA)分别为57.02%，58.56%，均高于FAO/WHO的比值(40%)[8]，说明鸡内金和鸡内金酶解物含有较高的营养价值。

表4 氨基酸组成分析Table 4 Analysis of amino acid composition

由表5可知，甲硫氨酸RC值最低，RC值>1表示该氨基酸相对过剩，RC值<1表示该氨基酸相对不足，RC值最小的氨基酸为限制氨基酸，故甲硫氨酸为二者的限制性氨基酸[17]。

表5 各种必需氨基酸的氨基酸比值(RAA)、比值系数(RC)及比值系数分(SRC)Table 5 RAA, RC and SRC of human essential amino acids

2.5 鸡内金酶解物相对分子质量分布

由图5和表6可知，鸡内金酶解物的数均分子量为108.50 Da，重均分子量为376.63 Da，峰位分子量为103.95 Da，平均分子量为1 057.4 Da。其中，相对分子质量<1 000 Da的酶解物所占比例为90.2%，相对分子质量为1 000～2 000 Da的酶解物所占比例为7.9%，相对分子质量为2 000～5 000 Da的酶解物所占比例为1.9%。说明酶解后，绝大部分难溶的大分子鸡内金蛋白被酶解成易溶于水的小分子多肽，更加有利于消化吸收[18]。

图5 鸡内金酶解物分子量分布图Figure 5 Molecular weight distribution diagram of enzymatic hydrolysate of galli gigerii endothelium corneum

2.6 鸡内金酶解物的抗氧化性

2.6.1 对DPPH自由基的清除能力 由图6可知，在0～10 mg/mL的质量浓度范围内，随着鸡内金酶解物质量浓度的提高，DPPH自由基清除率也随之提高。与谷胱甘肽相比，鸡内金酶解物的DPPH自由基清除效果较差，但与南极磷虾多肽[19]和乌贼墨多肽[20]的效果相当，说明鸡内金酶解物仍具有一定的抗氧化活性，能在一定程度上减轻机体的氧化损伤。

图6 鸡内金酶解物对DPPH自由基的清除能力Figure 6 Scavenging ability of enzymatic hydrolysis products of galli gigerii endothelium corneum on DPPH free radicals

2.6.2 对ABTS+自由基的清除能力 由图7可知，在0～10 mg/mL的质量浓度范围内，随着鸡内金酶解物质量浓度的提高，ABTS+自由基清除率也随之提高，且在1.5 mg/mL 质量浓度时，鸡内金酶解物对ABTS+自由基的清除率达(94.19±0.26)%，与谷胱甘肽的最大清除率相近，且与南极磷虾多肽[19]和乌贼墨多肽[20]相比，鸡内金酶解物具有较强的ABTS+自由基清除能力，说明鸡内金酶解物可能是多肽类抗氧化剂的良好来源。

图7 鸡内金酶解物对ABTS+自由基的清除能力Figure 7 Scavenging ability of enzymatic hydrolysis products of galli gigerii endothelium corneum on ABTS+ free radicals

3 结论

试验表明，鸡内金的最佳酶解工艺条件为利用中性蛋白酶和碱性蛋白酶共同酶解，酶解温度60 ℃，酶解时间9 h，酶解pH值11，蒸煮时间6 h，此条件下鸡内金多肽得率为75.68%，水解度为14.43%；该酶解工艺较好地保留了鸡内金氨基酸的多样性和营养价值，氨基酸组成与酶解前相差无几，相对分子质量<1 000 Da的酶解物所占比例为90.2%，使得鸡内金更易被人体消化吸收利用；此外，采用该工艺制备的鸡内金酶解物还具有一定的抗氧化活性。后续可分析酶解物中具体类别的多肽、单一多肽的提纯及特异生理功能。