四川产区蓝莓病原真菌的分离鉴定及精油成分对其的抑菌作用

刘春燕 丁 捷 邓尚贵 秦 文 刘 艳

(1. 浙江海洋大学食品与药学学院，浙江 舟山 316000；2. 四川农业大学食品学院，四川 雅安 625000；3. 四川旅游学院食品学院，四川 成都 610100)

四川省是中国主要的蓝莓鲜果供应地，2020年的总产量为5.0万t，位居全国第二[1]。蓝莓采后极易被病原真菌侵入造成腐烂发霉，分离鉴定蓝莓采后致腐的主要病原真菌是防治的关键，但侵染蓝莓致腐的病原真菌地域差异性较大。辽宁地区的病原真菌主要是灰葡萄孢、链格孢、青霉、粉红单端孢菌和产黄青霉[2-3]；浙江杭州的主要致腐病原真菌为灰葡萄孢、木霉和青霉[4]；贵州麻江县的采后腐烂病原真菌为间座壳属、链孢霉、球黑孢霉、内生真菌和灰霉菌[5]。目前尚未见四川产区蓝莓采后病原真菌的研究报道。

化学试剂杀菌是防治果实采后真菌性病害的主要途径，但频繁和高浓度的使用会造成环境和食品污染，还易诱导病原菌产生抗药性[6]，因此寻找安全高效的天然抗菌剂成为当务之急。王丹等[7-8]发现植物精油对果实采后病原菌的抑制效果较好。但植物精油中有效成分含量及生理活性受多种因素影响，其抑菌稳定性较差[9]。因此，精油成分对常见采后病原真菌的抑制逐渐成为研究热点[10-12]。目前已有香茅醇、丁香酚及麝香草酚等多种精油组分的相关报道[9,13]。研究拟以四川产区蓝莓在低温贮藏期的病果为试材，分离纯化病原真菌，并以优势病原真菌为目标菌株，筛选具有广谱抑菌效果的精油成分，以期为蓝莓采后病害防治和新型抑菌药剂研发提供理论依据。

1 材料与试剂

1.1 原料及处理

蓝莓(VacciniumSpp.)：采自四川省的14个商业种植基地，采摘后当日冷链运回实验室，剔除残次、病虫害及机械损伤的果实，挑选成熟度、颜色、大小基本一致的蓝莓为试材，于(2.0±0.5) ℃，RH 85%机械冷库中贮藏备用。

1.2 仪器设备及试剂

万分之一电子天平：FA2204B型，上海佑科仪器仪表有限公司；

高压灭菌锅：GI54DS型，厦门致微仪器有限公司；

生化培养箱：LRH-250F型，上海一恒科学仪器有限公司；

智能恒温恒湿培养箱：LHS-250型，郑州生元有限公司；

超净工作台：SW-CJ-2D型，武汉一恒苏净科学仪器有限公司；

显微镜：E100型，日本Nikon公司；

乙醇：分析纯，成都科隆化学试剂公司；

姜酮(97%)、香茅醇(95%)、丁香酚(99%)、D-柠檬烯(95%)、桉叶素(80%)、香芹酮(95%)、莰烯(75%)、月桂烯(90%)、松油醇(98%)、松油烯(95%)、麝香草酚(98%)、β-蒎烯(98%)、二烯丙基硫醚(98%)、肉桂醛(98%)、香芹酚(99%)：分析纯，罗恩试剂上海易恩化学技术有限公司。

1.3 蓝莓贮藏病原真菌的分离与纯化

采用常规组织分离法分离病原真菌。取果实病原交界处的组织(5 mm×5 mm)，分别用75%酒精和0.1%升汞处理30 s，无菌水冲洗后接种至PDA培养基上，于28 ℃ 培养48 h。挑取菌落边缘纯化3～5代，保存斜面备用。选择疑似病原真菌菌株，以有伤接种和无伤接种两种方式进行验证。以接种空白菌饼的为对照组，将培养皿置于25 ℃、RH 90%恒温恒湿培养箱中培养3～5 d。观察记录发病情况，按照柯赫氏法则，验证蓝莓贮藏疑似病原真菌的致病性。

1.4 病原真菌形态特征观察及分子鉴定

将病原真菌接种到PDA培养基上，28 ℃培养3～5 d，观察记录单菌落形态和菌丝孢子结构特征，参照真菌形态学鉴定手册进行分类鉴定。

采用真菌核糖体基因转录间隔区通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)对纯化病原真菌的基因组DNA进行PCR扩增后测序，利用SnapGene软件处理测序结果。将病原真菌序列和NCBI进行Blast比对，选取与病原真菌同源性高和形态相似的菌株序列构建系统发育树。

1.5 温度和光照对蓝莓采后优势及亚优势病原真菌菌丝生长的影响

采用点植法接种病原真菌，培养5 d后用十字交叉法测量菌落直径，分析环境温度(5，10，15，20，25，28，30，32，35，38 ℃)和光照条件(24 h全光照、12 h光暗交替的半光照和24 h全黑暗)对菌丝生长的影响。

1.6 基于信息熵法初筛具有广谱抑菌活性的精油成分

以四川产区蓝莓采后主要病原真菌为目标菌株，将供试精油成分用无水乙醇配制成有效质量浓度100 mg/L 的含药PDA培养基，采用点植法接种病原真菌。在28 ℃ 下培养5 d后用十字交叉法测量菌落直径，根据相对抑制率，用信息熵法综合评判精油组分的抑菌率。按式(1)计算菌丝生长相对抑制率。

(1)

式中：

R——相对抑制率，%；

A1——对照组直径，mm；

A2——处理组直径，mm。

1.7 麝香草酚对蓝莓采后优势及亚优势病原真菌的体内外抑菌活性

分别设置麝香草酚不同质量浓度(0，20，40，60，80，100，120，150 mg/L)的带药平板，采用点植法接种后置于28 ℃避光倒置培养，5 d后采用十字交叉法测量菌落直径，计算相对抑菌率。参考Aspera-Werz等[14]的方法使用AAT BioQuest的EC50计算器工具(https://www.aatbio.com/tools/ec50-calculator)，计算麝香草酚对不同菌株的半数有效浓度(EC50)。以无菌水处理为对照，每个浓度设置4个重复。

将Q1W1、Q2W19、Q2W22、Q3W7和Q3W25分别在PDA上培养5 d后制备1×107CFU/mL混合孢子悬浮液，喷洒到果子表面后晾干备用。以空白处理为对照，根据麝香草酚对不同菌株的半数有效浓度，将不同质量浓度(10，30，50，70 mg/L)的麝香草酚-1%吐温80水溶液喷施于已接种的蓝莓果实表面，分别标记为W10、W30、W50、W70。自然晾干后装入经75%酒精灭菌的塑料盒[(125±10) g/盒]，置于(2.0±0.5) ℃条件下贮藏，间隔2 d 监测蓝莓果实的发病情况。

Ir=n/N×100%，

(2)

式中：

Ir——发病率，%；

n——发病果子数量；

N——总的果子数量。

2 结果与分析

2.1 四川产区蓝莓采后发病情况调查

蓝莓果实在低温贮藏14 d后开始长霉腐烂，典型发病果实症状主要分为软溃腐烂(Q1型)、果蒂长毛腐败(Q2型)和青霉病(Q3型)3大类，其中Q1型软溃腐烂症状最为常见。Q1型病果表现为果实表皮上密生黑色粒状霉层，后期形成水渍状塌陷腐败区，果皮明显变薄且组织崩溃，果肉全部变红或褐变。Q2型病果主要是果蒂长毛腐烂，果蒂表层凸起絮状白色或灰色菌丝，与周围病果形成片状的霉层，后期菌丝滋生处果皮组织崩溃，果肉部分变红或褐变，伴有软糊状汁液渗出。Q3型病果在初期果蒂周围形成白色霉层，后期产生大量孢子，在果实表面形成致密状的青色或灰绿色霉层，感染处扁平或塌陷，果肉发生一定程度褐变，靠近果皮部位的果肉变红。

2.2 蓝莓采后病原真菌的分离频率及致病性

由表1可知，Q1W1是四川产区蓝莓采后病原真菌优势种，其分离频率为32.63%；Q2W22、Q3W25、Q2W19和Q3W7是亚优势种，分离频率>10%。Q1W11、Q2W13、Q2W20和Q2W26是第三大优势种群，分离频率<5%。由致病返接试验可知，上述菌株均为蓝莓采后致病菌，其反接致病症状与自然发病症状相似，且有伤接种的病害程度强于无伤接种，而对照组未见发病。在有伤接种条件下，优势种和亚优势种的发病率无显著差异(P>0.05)，Q1W1、Q2W19和Q2W22返接5 d后果实发病率为100%，Q3W7和Q3W25的发病率分别为92.59%和88.89%；而在无伤接种条件下，Q1W1、Q2W19和Q2W22的发病率均超过50%，其中Q1W1最高(62.96%)。综上所述，Q1W1是四川产区蓝莓低温贮藏期分离频率和发病率最高，且传染性最强的采后病原真菌，其发病症状同黑曲霉在枣果中的报道一致[15]，故暂将其在蓝莓上引发的症状称为蓝莓采后黑霉病。

表1 四川产区采后病原真菌相对分离频率和致病性†Table 1 Relative isolation frequency and pathogenicity of postharvest pathogens in Sichuan

2.3 蓝莓采后病原真菌的形态学特征

从发病果实病原交界处分离得到95株真菌，根据菌落形态和孢子形态初步分为9种，如图1所示。

图1 蓝莓采后病原真菌的菌株形态、孢子形态和回接症状Figure 1 Morphological characteristics of isolated strains and their symptoms after reconnection with blueberries

Q1W1和Q1W11菌落平坦而整齐，气生菌丝为白色短绒状，孢子在48 h后产生，但Q1W11的孢子更质密；显微镜下两株菌株的分生孢子头均为球形且菌丝光滑，无隔膜和分支，可初步判定为曲霉属。

Q2W13、Q2W19、Q2W20、Q2W22和Q2W26的菌落均呈绒毛状，菌丝为白色或者褐色，其中Q2W13需要在无菌松针(马尾松)的水琼脂培养基上才能产孢[16]；Q2W19在培养8 d后开始产孢。显微镜下的菌丝均细长；Q2W19的分生孢子呈烧瓶形，含5个细胞，具有4个分隔，顶端和基部各有附属丝2，1根；Q2W22的分生孢子呈倒棒状，有横隔；Q2W26的孢子梗顶端着生球形孢子囊，分生孢子为近球形或椭圆形。根据病原真菌的形态学特征结合参考文献[17]，将Q2W13、Q2W19、Q2W20、Q2W22和Q2W26初步鉴定为小新壳梭孢菌、类拟盘多毛孢属、禾谷镰刀菌、链铬孢属、毛霉属。其中链铬孢在东北和华东地区的蓝莓采后病原真菌中有相关报道。

Q3W7和Q3W25的菌落均呈地毯状，其中Q3W7菌落较平坦，而Q3W25菌落表面褶皱且营养菌丝深入培养基内部。在显微镜下Q3W7的分生孢子梗形如扫帚，分生孢子呈球形；而Q3W25的分子孢子顶生或侧生，形成短链，呈椭球型。根据病原真菌的形态学特征结合相关文献[2,18]，Q3W7和Q3W25初步鉴定为青霉属、枝孢菌属。青霉和枝孢菌主要是中国西南产区蓝莓采后的病原真菌。

2.4 蓝莓采后病原真菌的分子生物学鉴定

由图2可知，Q1W1和Q1W11分别和曲霉属中AspergillusnigerATCC16888，AspergillustubingensisNRRL 4875的亲缘关系比较接近，结合菌落形态分别鉴定为黑曲霉、塔宾曲霉菌。Q2W13、Q2W19、Q2W20、Q2W22、Q2W26分别与NeofusicoccumparvumstrainWZ-92、Neopestalotiopsissp.isolate2177、FusariumgraminearumisolateNRRL28302、AlternariaalternataisolateUASB8、MucorfragilisstrainLMSA 1.09.161的亲缘关系比较接近，结合菌落形态分别鉴定为小新壳梭孢菌、类拟盘多毛孢菌、禾谷镰刀菌、互生链铬孢菌和毛霉。Q3W7、Q3W25分别与Penicilliumsp.SAF6-EGY、CladosporiumxylophilumisolateFR1801的亲缘关系接近，结合菌落形态分别鉴定为噬木枝状枝孢菌、青霉菌。

图2 蓝莓采后病原真菌的系统发育Figure 2 Phylogenetic tree of postharvest pathogens of blueberry

2.5 温度和光照对蓝莓采后优势及亚优势病原真菌菌丝生长的影响

由图3可知，温度和光照对不同病原真菌菌丝生长的影响存在较大区别。Q1W1、Q2W19、Q2W22、Q3W7和Q3W25的菌落直径均随温度的升高呈先增加后降低的趋势；其中Q2W22的生长温度范围最广，在10～38 ℃的范围内均能生长；Q3W25的生长温度范围最小为15～30 ℃。根据菌落大小，Q1W1、Q2W19、Q2W22、Q3W7和Q3W25的最适生长温度分别为35，20，30，30，25 ℃。Q1W1、Q2W19和Q3W25最适宜光照条件为12 h光暗交替，Q2W22的最适宜光照是24 h光照，而Q3W7菌株的菌丝生长情况与培养期间光照时长无显著相关性。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图3 温度和光照对蓝莓采后病原真菌生长的影响Figure 3 Temperature and light on the growth of postharvest pathogenic fungi of blueberry

2.6 基于信息熵法初筛具有广谱抑菌活性的植物精油成分

将15种精油成分对蓝莓采后优势菌株的5 d生长抑制率通过信息熵重新确定权重系数，Q1W1、Q2W19、Q2W22、Q3W7和Q3W25的权重系数分别为0.364 158，-0.127 020，-0.009 360，0.536 662，0.235 562。根据式(3)计算综合抑制率，其值越大说明该精油成分的广谱抑菌效果越好。由表2可知，麝香草酚的综合抑制率最高为100%，其次是香芹酚(63.77%)、二烯丙基硫醚(36.20%)、肉桂醛(30.75%)、β-蒎烯(22.01%)和香茅醇(18.39%)，其余9种精油成分的综合抑制率均小于5%。

F=0.364 158R1-0.127 020R2-0.009 360R3+0.536 662R4+0.235 562R5，

(3)

式中：

F——综合抑制率，%；

R1、R2、R3、R4、R5——Q1W1、Q3W7、Q2W19、Q2W22和Q3W25菌丝的相对抑制率，%。

2.7 麝香草酚对蓝莓采后优势和亚优势病原真菌体内外抑菌活性

麝香草酚对蓝莓采后优势和亚优势病原真菌体内外抑菌活性见图4。由图4(a)可知，Thymol对Q2W22的抑制活性最小，EC50为(55.33±8.03) mg/L，显著高于其他菌株；而Q2W19、Q3W25、Q3W7和Q1W1的室内毒力无显著差异，其EC50分别为(29.80±3.65)，(31.98±2.07)，(35.35±7.42)，(38.18±7.56) mg/L。前人研究发现以麝香草酚为主要成分的百里香精油对链铬孢的EC50为18.456 μL/L[8]，肉桂—山苍子复合精油对黑曲霉的最小抑菌浓度为0.125 μL/mL[19]，均小于麝香草酚对中黑曲霉的EC50(38.18 mg/L)及链铬孢的EC50(55.33 mg/L)。这可能是由于精油是多种抑菌物质混合物，因此抑菌效果优于单一组分麝香草酚。但植物精油中的醇类、醛类和烯类物质因其原料来源和提取工艺差异性较大，对特定抑菌活性的贡献度是不确定、不稳定的[20]，因此极大限制了植物精油采后处理效果的稳定性。

由图4(b)可知，在整个常温贮藏期间，所有麝香草酚处理组的采后病害发病率均低于CK，均能有效控制真菌病害。W10组的发病率在4～8 d内显著低于同期的其他组。而W50和W70的发病率在常温贮藏4 d后急剧增加，分别为50.69%和53.90%，而W10仅从16.24%增加到31.92%。这可能是由于麝香草酚具有高植物毒性[21]，超过50 mg/L的施用浓度可能导致果实严重药害。

3 结论

以低温贮藏下自然发病的四川产区蓝莓为试材，共分离得到95株真菌，其中Aspergillusniger、Neopestalotiopsissp.、Alternariaalternat、Penicilliumsp.和Cladosporiumxylophilum是四川产区蓝莓采后的主要病原真菌。这5株菌的最适生长温度分别为35，20，30，30，25 ℃，其中Penicilliumsp.对光照反应不敏感，而其他菌株敏感。麝香草酚对上述5株菌的抑制效果较好，其半数有效浓度范围为30～50 mg/L。研究还发现麝香草酚水溶液的施用浓度和实际采后病害防治的应用效果不呈正比。因此较低浓度的麝香草酚水溶液具有防治蓝莓采后病害的潜力，可在未来作为广谱抑真菌成分研发高效安全的新型采后缓释抑菌剂。