高效液相色谱法测定糕点中脱氢乙酸的不确定度评定

黄潮 刘婷

摘 要：目的：通过高效液相色谱法测定市售糕点中脱氢乙酸，对不确定度的来源和影响因素进行全面分析。方法：根据脱氢乙酸测定过程，构建数学模型展开分析，确定测定过程不确定度的主要来源。结果：合成不确定度为 2.436 75 mg·kg-1，扩展不确定度为 4.873 5 mg·kg-1。结论：仪器稳定性、前处理过程及称量过程是不确定度的主要来源，测定过程中应重点关注。

关键词：高效液相色谱法；脱氢乙酸；不确定度

Evaluation of Uncertainty in the Determination of Dehydroacetic Acid in Cakes by High Performance Liquid Chromatography

HUANG Chao， LIU Ting

（Pingxiang Municipal Food and Drug Inspection Institute， Pingxiang 337000， China）

Abstract： Objective： Determination of dehydroacetic acid in commercial cakes by high performance liquid chromatography， and a comprehensive analysis of the sources and influencing factors of uncertainty. Method： According to the determination process of dehydroacetic acid， a mathematical model was constructed to carry out analysis to determine the main source of uncertainty in the determination process. Result： The combined uncertainty was 2.436 75 mg·kg-1， and the expanded uncertainty was 4.873 5 mg·kg-1. Conclusion： The instrument stability， pretreatment process and weighing process are the main sources of uncertainty and should be focused on in the determination process.

Keywords： high performance liquid chromatography; dehydroacetic acid; uncertainty

糕点的主要原料有谷类、薯类、豆类、糖、蛋和油脂等，经过一系列调制、烹制，这些原料最终成为美味的食物。为了获得更好的口感，人们在熟制糕点前后还经常向糕点中添加果酱、牛奶、可可与奶油等材料。

脱氢乙酸是当下较为常见的一种食品防霉防腐保鲜剂。目前，该材料的安全性已经被联合国粮农组织、世界卫生组织认可。这种物质能够在水溶液中逐步降解，且在这一过程中产生抑制与延缓肝癌的作用。即便是人体皮肤长期接触这一物质，也不会产生损伤。在实际应用中，这一物质并不会影响食物的口感，因此该物质常常被应用到糕点制作中[1]。脱氢乙酸以固态形式最为常见，呈无色结晶或淡黄色粉末，是一种低毒、高效的防腐、防霉剂。在酸、碱条件下均有一定的抗菌作用，尤其对霉菌的抑制作用最强，其化学名称为3-乙酰基-6-甲基-脱（2），4-脱（3）氢二酮，分子式为C8H8O4。根据《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）中规定糕点的脱氢乙酸最大使用量为0.5 g·kg-1（以脱氢乙酸计）。新国标GB 5009.121—2016中指出应用于食品领域的脱氢乙酸测定标准于2017年3月1日代替《食品中脱氢乙酸的测定》（GB/T 5009.121—2003）规定脱氢乙酸检测方法第一法为气相色谱法，第二法为液相色谱法。本文采用第二法高效液相法测定糕点中脱氢乙酸的含量，利用氢氧化钠溶液将试样内所含的脱氢乙酸提取出来，并采用脱脂与去蛋白的处理措施，过膜后借助紫外或二极管阵列检测器的高效液相色谱仪加以测定，根据色谱峰的留存时长来定性，运用外标法来进行定量。

由于脱氢乙酸的使用广泛，检测过程中遇到的问题也越来越多。如果检测结果接近国家规定限量值，会对判断样品的合格性带来困扰。在这种状况下，明确检测结果的不确定度非常关键。不确定度是一种直接与测量结果相关的参数，能够呈现出被测出量值的分散度。依据《检验检测机构资质认定能力评价 检验检测机构通用要求》（RB/T 214—2017）内的相关内容可知，检验检测机构应该构建起数学模型，并给出与其自身检验检测能力相对等的评定测量不确定度案例[2]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市面上销售的包装写有脱氢乙酸的糕点12份，样品编号为1—12；甲醇（CH4O），色谱纯；乙酸铵（C2H6O2N），优级纯；氢氧化钠（NaOH），分析纯；正己烷（C6H14），分析纯；甲酸（CH2O2），分析纯；硫酸锌（ZnSO4·7H2O），分析纯。

1.2 仪器与设备

Waters2695高效液相色谱仪，美国沃特世公司；分析天平（感量为0.1 mg和1 mg）；粉碎机；不锈钢高速均质器；超声波清洗器（功率35 kW）；涡旋混合器；离心机（转速＞4 000 r·min-1）；pH计；C18固相萃取柱：500 mg，6 mL（使用前用5 mL甲醇、10 mL水活化，使柱子保持湿润状态）。

1.3 检测方法[3]

参照国家标准《食品中脱氢乙酸的测定》（GB 5009.121—2016）测定糕点中脱氢乙酸的含量。样品参照第二法液相色谱法进行测定[3]。

1.3.1 样品制备

糕点用粉碎机制成粉末。

1.3.2 脱氢乙酸提取

参照国家标准《食品中脱氢乙酸的测定》（GB 5009.121—2016）第二法液相色谱法12.1.3面包、糕点、焙烤食品馅料、复合调味料测定，过0.45 μm有机滤膜，供高效液相色谱进行测定。

1.3.3 脱氢乙酸标准曲线

（1）脱氢乙酸（1.0 mg·mL-1）标准储备液。脱氢乙酸标准品精密（精确至0.000 1 g）称取0.100 0 g于100 mL容量瓶中，用10 mL氢氧化钠溶液（20 g·L-1）溶解，用水定容。4 ℃保存，3个月有效。

（2）脱氢乙酸标准工作液。分别吸取脱氢乙酸标准储备液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL和10.0 mL于100 mL容量瓶中，用水定容，配制成浓度分别为1.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1和100.0 μg·mL-1标准工作液，4 ℃保存，1个月有效。

1.4 数学模型

脱氢乙酸含量的计算公式为

（1）

式中：x为试样中脱氢乙酸的含量，g·kg-1；v为最终定容的体积，mL；c1为试样溶液内含脱氢乙酸的质量浓度，μg·mL-1；c0为空白试样内含脱氢乙酸的质量浓度，μg·mL-1；m为样品质量，g；f为过固相萃取柱换算系数（f=0.5）。

计算结果以重复条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值标识，计算结果保留两位有效数字。

2 结果与分析

2.1 分析不确定度的来源

通过测量及建模分析可知，对脱氢乙酸含量测定的不确定度产生影响的因素主要有以下几个方面[4]。①前期对影响因子进行处理时的相对标准不确定度ur（ f ），如测量过程中仪器自身的不稳定性、前期处理时或其他方面产生的影响。②实验人员标准溶液校准的相对标准不确定度ur（c），这是标准曲线的非线性造成的结果。③体积方面产生的相对标准不确定度ur（v）。该方面主要包括量具本身的误差、温湿度与人员等方面的影响。④质量的相对标准不确定度ur（m）。这一方面主要是由操作人员及天平在测量质量的过程中造成的结果。⑤重复性实验引入的相对标准不确定度ur（R）。

2.2 计算不确定度分量

2.2.1 样品稀释移取过程引入的相对标准不确定度ur（ f ）

（1）器具校准引入的相对标准不确定度ur（f1）。25 mL B级容量瓶定容，该器具的允差应控制在

0.06 mL内；10 mL A级单线移液管，该器具的允差应控制在0.02 mL内，由此可知因量器校准产生的相对标准不确定度为

ur（f1）

（2）样品稀释移取过程中人员读数引入的相对标准不确定度ur（ f2）。实验移取过程中，按照三角分布考虑，液体用量体积v的记录，当实验操作员读数允许约1%的不准确性（即0.01v），那么每次相对不确定度为，人员读数使用玻璃量器两次，由实验员读数引入的相对标准不确定度为ur（ f2），因此样品稀释移取过程中引入的相对标准不确定度为

2.2.2 标准溶液校准产生的相对标准不确定度ur（c）

（1）标准物质引入的标准不确定度ur（c1）。根据查阅脱氢乙酸批号为7700800证书，脱氢乙酸不确定度为0.5%，按照矩形分布，其相对标准不确定度为ur（c1）（2）标准物质称量引入的相对标准不确定度ur（c2）。查阅电子天平检定证书，根据国家标准《食品中脱氢乙酸的测定》（GB 5009.121—2016）规定，称取0.100 0 g脱氢乙酸标准品的允差应在0.000 5 g内，考虑均匀分布：u（m1） g，天平的重复性误差应控制在0.000 1 g内，u（m2）=5.77×10-5 g，称量而产生的标准不确定度u（c2）==0.000 3。因此，相对标准不确定度为ur（c2）=。

（3）工作曲线配制过程中引入的相对标准不确定度ur（c3）工作曲线标准溶液配制过程根据表1玻璃量器的不确定度[5]均匀分布计算，移液器不确定度按照正态分布计算，其相对标准不确定度为（4）标准工作溶液配制过程中人员读数引入的相对标准不确定度ur（c4）。按照三角分布考虑，液体用量体积v的记录，当实验操作员读数允许约1%的不准确性（即0.01v），那么每次相对不确定度为0.004 08，共读数6次，因此其相对标准不确定度ur（c4）

由于上述标准溶液校准引入的4个不确定度是单独存在的，因此标准溶液校准引入的相对标准不确定度为

（5）标准曲线拟合引入的相对标准不确定度ur（P）。以脱氢乙酸浓度c（μg·mL-1）为横坐标，峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线=3.182 692×104×c-

6.147 225×104，R2=0.999 7。对样品重复测量两次，测得脱氢乙酸的浓度为cx=20.33 μg·mL-1。标准曲线拟合相关数据见表2。

因此，ur（P）

其中，残差标准偏差为

离均差平方和

代入上述数值，得u（P）=1.66。因此，标准曲线的相对标准不确定度ur（P）=0.012。

（6）样品和标准工作峰面积引入的相对标准不确定度ur（a）。依据质管科waters高效液相色谱仪的近期检定证书可知，其定量重复性是0.3%，依照三角分布可知，不确定度是u（a）。由于ur（c），ur（a），ur（P）分别为各自不相关的量，因此由标准溶液校准引入的相对标准不确定度为

2.2.3 样品称量引入的相对标准不确定度ur（m）

称取样品5.017 8 g，天平最大允差为0 g，天平重复性误差为0 g，其不确定度分别为g，

g，称量引入的标准不确定度为u（m）=

g，则相对标准不确定度ur（m）=

2.2.4 定容体积引起的相对标准不确定度ur（v）

样品经提取净化后，用1 mL移液器取1 mL流动相定容。

（1）定容量器引入的不确定度。1 mL移液器的最大允差为0.002 mL，按均匀分布，其标准不确度为u（v1）mL

（2）定容量器读数引入的不确定度。由上可知，由实验操作员定容产生的u（v2）=0.004 08 mL，因此 mL，相对标准不确定度为。

2.2.5 重复性实验的相对标准不确定度ur（R）

（1）重现性的不确定度。对样品进行10次平行样的重复上机测试，测量数据见表3。

测定结果的标准偏差及相对不确定度为

因此，由重复性实验引入的相对标准不确定度为1.24/256.5=0.004 8

（2）回收率的不确定度。样品采取10次平行样加标回收测试，回收率数据见表4。

由表4可知，其平均加标回收率为86.03%，标准偏差为0.30%。因此，回收率引入的相对标准不确定度是0.30/86.03=0.003 5。

因此，重复性产生的相对标准不确定度为

ur（R）

2.3 相对标准不确定度的合成及扩展

2.3.1 合成标准不确定度

各相对标准不确定度结果见表5。

2.3.2 扩展不确定度评定

脱氢乙酸含量为256.5 mg·kg-1，则测量结果的合成标准不确定度为uc（x）=256.5×0.009 5=2.436 75 mg·kg-1。

扩展不确定度可由合成标准不确定度乘以包含因子，取置信水平95%，包含因子k=2，可知糕点中脱氢乙酸测定的相对扩展不确定度为U=u（x）×k=

4.873 5 mg·kg-1。

2.3.3 测量不确定度报告

样品中脱氢乙酸含量的测定结果为（256.5±4.873 5）mg·kg-1，k=2。

3 结论

本研究参照国家标准《食品安全国家标准食品中脱氢乙酸的测定》（GB 5009.121—2016）测定糕点中脱氢乙酸的含量，样品参照第二法液相色谱法进行测定，并依据由国家质量监督检验检疫总局发布的《测量不确定度评价与表示》（JJF 1059.1—2012），综合检验的各项标准与构建的数学模型，借助waters高效液相色谱仪对糕点中脱氢乙酸的结果进行不确定度评定，对不确定影响因素展开研究，针对测量过程中多项影响因素带来的不确定度展开分析与评价。在本次研究中涉及的影响因素包括实验环境、常用器皿、人员操作、仪器的稳定性与精密度等。其中，仪器不稳定、前处理和其他因素影响以及称量过程中人员和天平是对实验结果产生影响的主要方面。因此，实验时应对标准品配制中的准确性提出更高的要求，质管科应定期检定仪器与设备的精密程度与稳定性，以季度为周期核查好相关内容，使仪器能满足实验需要。同时，在实验过程中保持实验环境的一致性，在日常检验过程中重视实验人员的操作能力与操作的规范性，降低人为操作不佳带来的不利影响，从而使檢测结果更准确。

参考文献

[1]赵宇明，董广彬，时华捷.糕点和面包中脱氢乙酸两种不同检测方法的比较研究[J].粮油与饲料科技，2021（1）：21-24.

[2]何家国，苏旭，杜鑫，等.气相色谱-串联质谱法测定柑橘中苯醚甲环唑的不确定度评定[J].现代农业科技，2021（24）：197-200.

[3]国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定：GB 5009.121—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[4]中国合格评定国家认可委员会.化学分析中不确定度的评估指南：CNAS—GL06[S].（2006-06-01）[2022-07-30].https：//www.doc88.com/p-9743775644701.html.

[5]国家质量监督检验检疫总局.常用玻璃量器检定规程：JJG 196—2006[S].北京：中国计量出版社，2006.