适配体修饰的绞股蓝皂苷靶向脂质体的制备及抗肿瘤研究*

赖宗强，吴丽宁，黎渊弘，唐云峡

（广西医科大学第二附属医院药学部，南宁 530007）

目前肝癌治疗困难，常规治疗手段进入瓶颈，难以取得新突破。现代研究证实绞股蓝皂苷（gypenosides，Gyp）具有抗多种肿瘤功效[1]，具有巨大开发潜力。但是绞股蓝用于抗肿瘤时本身缺乏靶向性，药物作用效率不高，而且绞股蓝总皂苷口服后很容易被降解代谢[2-3]，因此需要大剂量或频繁给药。因此，迫切需要研发新型靶向药物制剂提高绞股蓝的抑癌效果，同时改善其吸收代谢，才有利于绞股蓝的进一步推广和应用。中药纳米载药制剂可提高药物的生物利用度[4]，提高药物的稳定性，还可以通过修饰原件增强中药的靶向性[5]。脂质体是应用最多的中药纳米制剂载体之一，其具有优良的生物相容性、生物安全性，易通过各种修饰实现靶向性等特点[6-7]。适配体（aptamer，Apt）是一类经筛选得到的单链DNA或RNA，可通过三维结构以高亲和力特异性结合在靶标上，具有分子量小、易于修饰合成、低毒低、低免疫原性、组织渗透性强等优势。因此，Apt被广泛应用于药物靶向治疗及肿瘤检测等领域[8-10]。用Apt修饰中药载药系统的研究鲜有报道。因此本研究基于Gyp的抗肝癌作用，结合脂质体载药的优良特性，连接能够靶向肿瘤标志物Ep-CAM的Apt（SYL3C）[11]，制备中药纳米载药系统SYL3C-Gyp@Lipo，并检测其表征特性、药物释放度及对肝癌细胞的靶向杀伤功能。

1 材料与方法

1.1主要材料

鞘磷脂（SM）、胆固醇（Chol）、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）、DSPEPEG（2000）-MAL均购自Avanti polar lipids公司（USA）。Gyp购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，DMSO试剂、MTT试剂盒购自博士德公司，枸橼酸钠缓冲液、香草醛、Cy 5.5荧光染料、鱼精蛋白、Triton X-100均购自北京索莱宝科技有限公司，聚碳酸酯膜购自密理博中国有限公司，其余试剂均为分析纯级别。Apt由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其序列为：5’-CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-（T）5-SH-3’。

1.2实验仪器

Sorvall Biofuge Stratos型高速离心机（德国Thermo公司），Alpha1-4 LSC型冷冻干燥机（德国Martin Christ公司），L-117小型喷雾干燥器（北京来亨仪器设备有限公司），TU-1901型双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），Nano-S型激光粒度分析仪（英国Malvern公司），H-7650型透射电子显微镜（日本日立公司）。

1.3实验方法

1.3.1 Apt功能化的Gyp靶向脂质体的制备 将溶解在氯仿中的SM、Chol、DSPE-PEG2000和DSPEPEG（2000）-MAL按摩尔质量比55∶40∶4.7∶0.3加入圆底烧瓶中，旋转蒸发仪60℃蒸发10 min，形成干燥薄膜，真空干燥仪干燥过夜以去除残留的有机溶剂。将瓶底的脂质薄膜用l mL 300 nmol的枸橼酸缓冲液（pH=4.0）进行水化，50℃水浴超声20 min后，在液氮、60℃水浴反复冻融5次。将产物装入脂质体挤推器，依次通过200 nm、100 nm的聚碳酸酯膜各20次，形成直径在100 nm左右的空白脂质体Lipo。按照药物∶脂质体比1∶10，取适量空白脂质体和Gyp PBS溶液（1 mg/mL），45℃恒温振摇90 min，冰浴条件下探头超声10 min（超声时间2 s，间隔时间2 s，功率为100 W），即制备包裹Gyp的脂质体Gyp@Lipo，透析除去游离的Gyp。取包药脂质体Gyp@Lipo 10 mg，加入2 nmol的SYL3C Apt，氮气保护环境下室温反应24 h。加入2 nmol的β-半胱胺除去未反应的MAL基团。透析除去多余的β-半胱胺和SYL3C，即得靶向药物传递系统SYL3CGyp@Lipo，4℃储存备用。为了进行荧光表征，制备荧光脂质体，即在上述加入绞股蓝步骤中额外加入占总脂质体质量0.5%的Cy 5.5红色荧光染料，可得到带红色荧光的脂质体：Gyp@Lipo-Cy5.5和SYL3C-Gyp@Lipo-Cy5.5。

1.3.2 Gyp定量分析方法的建立[12] Gyp对照品和空白脂质体用5%香草醛冰醋酸溶液—高氯酸（2∶8）混合液显色，在400～1 100 nm处进行光谱扫描，得到最大吸收波长为555 nm，且该处空白脂质体无干扰，故选择测定波长为555 nm。然后建立定量分析Gyp的标准曲线，即精密称取Gyp对照品，加水配置成质量浓度为0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL的系列对照品溶液。分别取对照品溶液1 mL置于15 mL具塞试管中，精密加入混合液2 mL，摇匀，密塞，置60℃水浴中加热15 min，取出，立即放入冰水中冷却2 min，精密加入冰醋酸10 mL，摇匀，以试剂作空白，分光光度法于（555±5）nm波长处测定吸光度（A）值。以A值为纵坐标，质量浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.3包封率测定 采用鱼精蛋白沉淀法进行测定。吸取2 mL SYL3C-Gyp@Lipo，添加0.5 mL鱼精蛋白（10 mg/mL）混匀，接着加入3 mL生理盐水并静置5 min，然后离心30 min（3 000 r/min）。收集沉淀，加入10%曲拉通-X100溶解，用生理盐水定容，然后取溶液测定Gyp含量，即得到包封的药物量。

1.3.4载药脂质体的表征 使用Zetasizer分析仪（Nano S）动态光散射法（Dynamic light scattering，DLS）对样品粒径和电位大小进行测量；通过透射电子显微镜H-7650观察拍摄样品的形态。

1.3.5释放度考察 使用离心方法进行体外药物释放实验，即将10 mg SYL3C-Gyp@Lipo在37℃下溶于10 mL pH 5.4或pH 7.4的PBS缓冲液中，以100 r/min摇动。在预定的时间间隔，将样品以5 000 r/min离心10 min，收集上清，通过前述分光光度法测定上清液中的Gyp含量，计算释放率。

1.3.6靶向性检测 为研究载药脂质体与HepG2细胞的靶向结合能力，采用流式细胞仪进行检测。取对数生长期的HepG2和HL-7702细胞（人肝正常细胞），用50μL PBS重悬细胞。加入45μL PBS、10μL胎牛血清（FBS）和各组材料（Gyp@Lipo-Cy5.5和SYL3C-Gyp@Lipo-Cy5.5，浓度为500μg/mL）混匀，加入细胞混悬液，混匀，于4℃下避光孵育30 min，然后PBS洗涤细胞，1 000 r/min离心5 min。重复洗涤细胞3次并重悬，流式细胞术检测荧光脂质体与细胞的结合率。

1.3.7药物传递系统对肿瘤细胞的杀伤性考察

使用MTT法测定药物体外细胞毒性。每组设6个复孔，取对数生长期的HepG2和HL-7702细胞，接种于96孔板内，细胞数控制在1.5×104个/孔。随后加入药物与细胞共培养，根据加入药物不同，设置分组为：Gyp组（加入Gyp）、Gyp@Lipo组（加入Gyp@Lipo脂质体）、SYL3C-Gyp@Lipo组（加入SYL3C-Gyp@Lipo脂质体）；每组设置不同给药浓度（脂质体中Gyp含量浓度），设置4个给药浓度为：100 µg/mL、300 µg/mL、600 µg/mL、900 µg/mL。分组给药后，将细胞在5% CO2、37℃培养箱中培养24 h。孵育结束后，每孔细胞分别加入20μL MTT，置于37℃、5%CO2的培养箱中30 min；1 500 r/min离心10 min，弃去上清，每孔加入200μL DMSO，避光振荡10 min，之后用全自动酶标仪检测570 nm波长处的OD值。为了进一步验证脂质体的靶向杀伤性能，本研究设计了封闭实验，设置SYL3C封闭组，即先将HepG2细胞与过量Apt SYL3C先孵育2 h，PBS洗涤后再加入SYL3C-Gyp@Lipo进行共培养24 h；还设置分组：Free SYL3C组，即单纯Apt SYL3C与细胞共孵育24 h；SYL3C-Gyp@Lipo组，即脂质体SYL3C-Gyp@Lipo与细胞共孵育24 h。孵育结束后各组按前述步骤进行细胞毒性检测。

1.4统计学方法 采用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计分析。计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1靶向载药脂质体的表征

通过分光光度法建立Gyp定量分析的标准曲线，以吸光度（A）值为纵坐标，质量浓度（C）为横坐标，进行线性回归，得回归方程A=0.317 9 C+0.088 49，r=0.993 4，由此可计算出载药脂质体的Gyp包封率为63.87%。

通过TEM（图1A）可以看到，制备的载药纳米粒子SYL3C-Gyp@Lipo分散性良好，大小均匀，呈现圆球形或椭圆球形，同时可以观察到脂质体的双层膜。表明载药纳米脂质体制备成功。各组纳米粒子的电位分布和粒径分布见图1B和图1C：空白脂质体Lipo的平均水化粒径为121.23 nm，在包裹Gyp药物和修饰SYL3C Apt后，平均粒径分别增大至128.24 nm与133.28 nm。空白脂质体表面电荷为+（12.87±1.24）mV，包裹药物后降为+（7.53±1.29）mV；SYL3CApt为带负电的DNA，故修饰后脂质体表面电位进一步降至-（10.15±1.35）mV，这也说明Apt修饰成功。

图1 载药脂质体的表征

2.2靶向载药脂质体的体外药物释放率

在pH为7.4时，SYL3C-Gyp@Lipo载药脂质体释放缓慢，96 h内释放药物不超过80%，说明与游离药物相比，脂质体制剂呈现出一定的缓释作用；而为了模拟载药脂质体进入肿瘤微酸环境的释放，研究设计了在pH为5.4时观察载药脂质体的释放情况，可以看到，在pH 5.4的酸性环境下，SYL3CGyp@Lipo释药速度较快，48 h释放率就已超过80%，而经过96 h释放率超过90%，见图2。

图2 SYL3C-Gyp@Lipo在不同pH值（pH 7.4、pH 5.4）环境96 h内药物累积释放曲线图

2.3靶向载药脂质体的体外靶向实验

为了确定靶向载药脂质体的体外肿瘤靶向能力，使用流式细胞术分析比较SYL3C-Gyp@Lipo的细胞结合效率（图3）。结果可以看到非靶细胞HL-7702对SYL3C-Gyp@Lipo没有特异性结合（图3B），而靶细胞HepG2细胞与SYL3C-Gyp@Lipo的结合率明显较高（图3A）。

图3 流式细胞术检测载药脂质体SYL3C-Gyp@Lipo的体外靶向性能

2.4靶向载药脂质体对肿瘤细胞的体外杀伤性

当脂质体与HL-7702细胞共孵育时（图4A），在相同Gyp药物浓度下，SYL3C-Gyp@Lip组与Gyp@Lipo组的细胞活力无明显差异（P＞0.05）；然而与HepG2细胞共孵育（图4B），当Gyp含量浓度大于300μg/mL，SYL3C-Gyp@Lipo比Gyp@Lipo具有更明显的细胞杀伤能力（P＜0.05），且呈剂量依赖性，但是其毒性也略低于游离Gyp（P＜0.05）。通过靶向脂质体SYL3C-Gyp@Lipo对不同细胞的杀伤效果差异进行比较（图4C），结果显示当给药浓度Gyp含量大于300μg/mL，SYL3C-Gyp@Lipo对HepG2细胞的杀伤能力强于HL-7702细胞（P＜0.05）。

图4 靶向载药脂质体的体外细胞毒性

为了进一步验证脂质体的靶向杀伤性能，本研究设计了封闭实验，从结果中可以看出（图5），游离Apt SYL3C对HepG2细胞活力几乎无影响，细胞活力保持在90%左右；而封闭组和SYL3C-Gyp@Lipo组对细胞均有抑制作用，但SYL3C-Gyp@Lipo组对细胞的杀伤效果更好，该组细胞活力更低（P＜0.05）。

图5 载药脂质体的特异靶向杀伤肿瘤细胞功能验证

3 讨论

Gyp通过多靶点多途径发挥抗癌功效，但是经口服用途径很容易被降解，因此需要大剂量或频繁给药。而将Gyp制备成载药脂质体后，在胃肠道中能够受到保护，避免被快速代谢，可减少每次给药剂量；另外脂质体还有缓释功能，能减少给药频率。但是Gyp脂质体制剂的靶向性、药物传递效率有待提高。因此本研究选用能特异性靶向肿瘤标志物的Apt SYL3C，用Apt修饰Gyp脂质体（Gyp@Li-po），构建一个可保护药物且具有缓释功能的靶向药物传递系统（SYL3C-Gyp@Lipo）。

本研究通过薄膜分散法制备的脂质体，制备过程中添加了PEG2000，PEG2000不仅增加了纳米脂质体在体内的循环时间，而且由于PEG层的存在，可在脂质体膜内、外形成空间位阻，从而阻碍水分子及药物分子跨膜流动[13]，不仅起到保护药物作用，避免其在胃肠道快速降解，还使得载药脂质体在96 h内呈现出一定地缓释作用，延长了药物在体内的循环时间及药物在肿瘤局部的暴露时间。肿瘤细胞内为微酸性环境，所以本研究探索了pH为5.4的酸性环境下药物的释放情况，结果显示48 h释放率80%以上，96 h释放了90%以上。在酸性环境下药物的快速释放，可能是因为酸性环境下脂质体结构的裂解而造成的。已经进入细胞的脂质体裂解释放的大量药物，可以迅速发挥作用，抑制细胞的增殖，增强了对细胞的杀伤作用。

上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）可作为多种肿瘤的诊断标志和治疗靶标，在本研究中，靶向EpCAM的SYL3C Apt的修饰赋予了纳米脂质体的肿瘤识别性能，增强了药物的主动靶向传递。对比表达EpCAM的肝癌细胞HepG2和不表达EpCAM的正常肝细胞HL-7702，由于SYL3C Apt的修饰，增强了肿瘤细胞对SYL3CGyp@Lipo的识别，因此HepG2对载药脂质体SYL3C-Gyp@Lipo的摄取更多；MTT实验也提示SYL3C-Gyp@Lipo能特异性杀伤HepG2肿瘤细胞。为进一步证实脂质体的靶向杀伤性能，用Apt YL3C封闭结合位点后再与SYL3C-Gyp@Lipo共培养，载药脂质体的细胞杀伤性能明显降低，也再次表明SYL3C-Gyp@Lipo对肿瘤细胞的主动靶向杀伤性能，使得SYL3C-Gyp@Lipo特异性地作用于肿瘤细胞，减少对正常细胞的毒副作用。而且，由于EpCAM在多种肿瘤细胞表达，在理论上SYL3CGyp@Lipo也能够靶向其他的肿瘤细胞，起到广泛的肿瘤特异性杀伤作用。

本研究制备了一个具有高效载药的Apt功能化的Gyp靶向脂质体纳米药物传递系统。这个系统由于Apt能够特异性的识别并结合肿瘤特异位点，以及由于脂质体对药物的缓释等优良性能，使得纳米药物传递系统能够富集肿瘤部位并对其持续杀伤。此外，通过选择合适的不同的Apt，理论上它可以靶向任何类型的肿瘤细胞，对肿瘤的靶向治疗具有巨大潜力。因此，也为绞股蓝乃至中药制剂的研究和应用提供了新思路。