EZH2抑制剂对膀胱癌T24细胞上皮间质转化的影响及其机制研究*

陈翔，何天基，冉俊武，王伟，姚远，周毅，石海林

（柳州市人民医院泌尿外科，广西柳州 545000）

膀胱癌是泌尿系统常见恶性肿瘤，发病率居男性恶性肿瘤前列，且发病率和病死率逐年升高[1]。膀胱癌细胞主要为尿路上皮细胞，有研究显示，上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）是上皮来源恶性肿瘤细胞侵袭及转移的主要原因之一，与病情进展关系密切[2]。Zeste基因增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2, EZH2）是多梳蛋白抑制复合物家族成员之一，可催化组蛋白H3 的甲基化过程，参与调控多种靶基因沉默。有研究显示，EZH2 与膀胱癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤的发生、发展关系密切[3-4]。GSK126 是一种新型的EZH2 抑制剂，可抑制肿瘤细胞中EZH2 高表达状态。目前，关于GSK126 对膀胱癌细胞EMT 过程的调控报道较少，本研究旨在探究其对膀胱癌T24 细胞EMT 过程的影响及可能机制，为膀胱癌的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞系

人膀胱癌细胞系T24 购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，置于含100 u/mL 青霉素、100 mg/L 青霉素的RPMI 1640 培养基，在37℃、5%二氧化碳及饱和湿度条件下培养。

1.2 主要试剂及仪器

EZH2 抑制剂GSK126、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）（美国Sigma 公司），Matrigel 基质胶（美国Corning 公司），RPMI 1640 培养基、胎牛血清（武汉普诺赛生命科技有限公司），实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）试剂盒（美国Thermo Fisher 公司），兔抗人EZH2、β-catenin 单抗、小鼠抗人Ecadherin、Vimentin、非受体型酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）、磷酸化JAK2（p-JAK2）、信号转导及转录活化因子3（STAT3）、磷酸化STAT3（p-STAT3）单抗（美国Abcam 公司），辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）标记的IgG 相应二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

Transwell 小室（美国Corning Incorporated 公司），7300 qRT-PCR 仪（美国ABI 公司），电泳仪（美国Bio-Rad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 药物配置将GSK126 溶于DMSO 中获得浓度为2 000 μmol/L 的母液，置于-20℃冰箱冷冻保存备用，实验前用RPMI 1640 培养基稀释至终浓度为10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L 的GSK126 溶液。

1.3.2 分组及干预方法取对数生长期的T24 细胞，胰蛋白酶消化，调整细胞密度为1.5×105个/mL，重新接种于96 孔板，随机分为空白组、GSK126 低剂量组、GSK126 中剂量组、GSK126 高剂量组，每组设5 个复孔，贴壁生长后，吸去培养基，分别用终浓度为0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L 的GSK126细胞培养基继续培养。

1.3.3 MTT法检测细胞增殖能力取4组干预24 h、48 h、72 h 的T24 细胞，每孔加入5 g/L 新鲜制备的MTT 溶液，继续培养4 h，吸去培养基，每孔加入DMSO 150 μL，充分混匀溶解结晶，用酶标仪检测290 nm 波长处的吸光度（Absorbance, A）值，A 值越大代表细胞密度越高，增殖能力越强。

1.3.4 Transwell法检测细胞侵袭能力取4 组干预24 h 的T24 细胞，胰蛋白酶消化，RPMI 1640 培养基重悬，调整细胞密度为2.0×105个/mL 备用。RPMI 1640 培养基与Matrigel 基质胶按1∶6 稀释，包被Transwell 小室滤膜，置于24 孔板，上层加入各组细胞悬液2.0×105个/mL，下层加入含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基，继续培养48 h，无菌棉签擦除滤膜上层细胞，结晶紫染色，随机取5 个视野，计数穿膜细胞数[5]。

1.3.5 划痕实验检测细胞迁移能力取4 组T24 细胞接种至24 孔板，待细胞融合为单层细胞后，用无菌枪头在培养板上划直线，培养液冲洗划痕使其边缘整齐，拍照测量初始划痕宽度，各组加入相应浓度含药培养基后同条件继续培养48 h，再次拍照测量划痕宽度，计算细胞迁移率，细胞迁移率%=[（初始划痕宽度-48 h 划痕宽度）/初始划痕宽度]×100%。

1.3.6 qRT-PCR检测EZH2、E-cadherin、Vimentin、β-catenin mRNA 的表达收集各组GSK126 干预48 h 细胞，采用TRIzol 法提取细胞总RNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶标仪测定RNA 浓度，逆转录成cDNA，进行qRT-PCR 反应。按照试剂盒说明书设定20 μL反应体系：SYBR Premix Ex Taq 10.5 μL，10 μmol/L正反向引物各1.0 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 5.5 μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性15 s，28℃退火45 s，72℃延伸60 s，共38 个循环。以β-actin 为内参对照，用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.7 Western blotting 检测EZH2、EMT 和JAK2/STAT3信号通路相关蛋白的表达收集各组GSK126干预48 h 细胞，转移至离心管，加入500 μL 细胞裂解液，冰上裂解25 min，12 000 r/min 离心15 min，离心半径10 cm，取上清液沸水水浴10 min，BCA 法测定总蛋白，取50 μg 蛋白进行恒定电流的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转仪转分离胶至硝酸纤维素膜，加入封闭液室温封闭2 h，加入EZH2（1∶200）、E-cadherin（1∶200）、Vimentin（1∶400）、βcatenin（1∶200）、p-JAK2（1∶400）、JAK2（1∶400）、p-STAT3（1∶200）、STAT3 一抗（1∶200），4℃过夜，TBST充分洗涤，加入1∶2 000 稀释相应二抗，室温孵育4 h，TBST 再次洗涤，化学发光法显影。采用Image J 图像分析软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白与内参β-actin 灰度值的比值，即为该蛋白相对表达量。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，进一步两两比较用SNK-q法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力比较

空白组及GSK126 低、中、高剂量组细胞培养24 h、48 h、72 h 的增殖能力比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间细胞增殖能力有差异（F=15.498，P=0.000）；②4 组细胞增殖能力有差异（F=5.162，P =0.013）；③4 组细胞增殖能力变化趋势有差异（F=12.314，P=0.000）。进一步两两比较结果：细胞培养24 h，GSK126 中、高剂量组细胞增殖能力低于空白组（P＜0.05），且GSK126 高剂量组低于GSK126 中剂量组（P＜0.05）；细胞培养48 h 和72 h，GSK126 低、中、高剂量组细胞增殖能力低于空白组（P＜0.05），且随GSK126 剂量升高而降低（P＜0.05）；随着时间延长，各组细胞增殖能力均增强（P＜0.05）。见表2。

表2 各组细胞增殖能力比较 （±s）

表2 各组细胞增殖能力比较 （±s）

注：①与24 h比较，P ＜0.05；②与48 h比较，P ＜0.05；③与空白组比较，P ＜0.05；④与GSK126低剂量组比较，P ＜0.05；⑤与GSK126中剂量组比较，P ＜0.05。

72 h 0.950±0.072①②0.701±0.067①②③0.621±0.060①②③④0.422±0.056①②③④⑤组别空白组GSK126低剂量组GSK126中剂量组GSK126高剂量组24 h 0.314±0.041 0.301±0.038 0.294±0.042③0.280±0.035③④48 h 0.571±0.062①0.511±0.060①③0.494±0.054①③④0.350±0.052①③④⑤

2.2 各组细胞侵袭和迁移能力比较

空白组及GSK126 低、中、高剂量组穿膜细胞数、迁移率比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=79.685 和52.3001，均P=0.000）。进一步两两比较结果：与空白组比较，GSK126 低、中、高剂量组穿膜细胞数、迁移率均降低（P＜0.05），且随GSK126 剂量升高而降低（P＜0.05）。见表3。

表3 各组穿膜细胞数、迁移率比较 （±s）

表3 各组穿膜细胞数、迁移率比较 （±s）

注：①与空白组比较，P ＜0.05；②与GSK126低剂量组比较，P ＜0.05；③与GSK126中剂量组比较，P ＜0.05。

迁移率/%85.49±9.20 62.31±9.11①43.20±8.54①②36.87.±6.21①②③52.301 0.000组别空白组GSK126低剂量组GSK126中剂量组GSK126高剂量组F 值P 值穿膜细胞数/（个/HP）120.40±11.37 94.20±10.26①53.80±10.20①②31.60±9.51①②③79.685 0.000

2.3 各组EZH2、E-cadherin、Vimentin、β -catenin mRNA相对表达量比较

空白组及GSK126 低、中、高剂量组EZH2、Ecadherin、Vimentin、β-catenin mRNA 相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=198.091、95.147、85.140 和60.217，均P=0.000）。进一步两两比较结果：与空白组比较，GSK126 低、中、高剂量组EZH2、Vimentin、β-catenin mRNA 相对表达量均降低（P＜0.05），且随GSK126 剂量升高而降低（P＜0.05）；与空白组比较，GSK126 低、中、高剂量组E-cadherin mRNA 相对表达量均升高（P＜0.05），且随GSK126 剂量升高而升高（P＜0.05）。见表4。

表4 各组EZH2、E-cadherin、Vimentin、β-catenin mRNA相对表达量比较 （±s）

表4 各组EZH2、E-cadherin、Vimentin、β-catenin mRNA相对表达量比较 （±s）

注：①与空白组比较，P ＜0.05；②与GSK126低剂量组比较，P ＜0.05；③与GSK126中剂量组比较，P ＜0.05。

组别空白组GSK126低剂量组GSK126中剂量组GSK126高剂量组F 值P 值β-catenin 1.89±0.13 1.56±0.12①1.12±0.10①②0.91±0.11①②③60.217 0.000 EZH2 2.05±0.13 1.64±0.10①1.02±0.11①②0.53±0.08①②③198.091 0.000 Vimentin 1.05±0.07 0.84±0.07①0.62±0.06①②0.35±0.05①②③95.147 0.000 E-cadherin 0.78±0.08 0.91±0.09①1.20±0.11①②1.54±0.10①②③85.140 0.000

2.4 各组EZH2、EMT相关蛋白相对表达量比较

空白组及GSK126 低、中、高剂量组EZH2、Ecadherin、Vimentin、β-catenin 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=532.016、107.842、253.016 和305.871，均P=0.000）。进一步两两比较结果：与空白组比较，GSK126 低、中、高剂量组EZH2、Vimentin、β-catenin 蛋白相对表达量均降低（P＜0.05），且随GSK126 剂量升高而降低（P＜0.05）；与空白组比较，GSK126 低、中、高剂量组Ecadherin 蛋白相对表达量升高（P＜0.05），且随GSK126 剂量升高而升高（P＜0.05）。见表5和图1。

图1 各组EZH2、EMT相关蛋白的表达

表5 各组EZH2、EMT相关蛋白相对表达量比较 （±s）

表5 各组EZH2、EMT相关蛋白相对表达量比较 （±s）

注：①与空白组比较，P ＜0.05；②与GSK126低剂量组比较，P ＜0.05；③与GSK126中剂量组比较，P ＜0.05。

组别空白组GSK126低剂量组GSK126中剂量组GSK126高剂量组F 值P 值β-catenin 1.21±0.10 0.91±0.07①0.70±0.08①②0.34±0.05①②③305.871 0.000 EZH2 0.85±0.07 0.42±0.040.95±0.08 0.16±0.04①②0.62±0.07①②0.07±0.02①②③0.37±0.06①②③532.006107.842 0.0000.000①Vinentin 1.87±0.12①E-cadherin 0.15±0.04 0.26±0.05①0.42±0.06①②0.79±0.07①②③253.016 0.000

2.5 各组JAK2/STAT3 信号通路相关蛋白相对表达量比较

空白组及GSK126 低、中、高剂量组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=159.007 和217.835，均P=0.000）。进一步两两比较结果：与空白组比较，GSK126 低、中、高剂量组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相对表达量均降低（P＜0.05），且随GSK126 剂量升高而降低（P＜0.05）。见表6和图2。

图2 各组JAK2/STAT3信号通路相关蛋白的表达

表6 各组JAK2/STAT3信号通路相关蛋白相对表达量比较 （±s）

表6 各组JAK2/STAT3信号通路相关蛋白相对表达量比较 （±s）

注：①与空白组比较，P ＜0.05；②与GSK126低剂量组比较，P ＜0.05；③与GSK126中剂量组比较，P ＜0.05。

p-STAT3/STAT3 0.91±0.12 0.75±0.08①0.46±0.07①②0.22±0.05①②③217.835 0.000组别空白组GSK126低剂量组GSK126中剂量组GSK126高剂量组F 值P 值p-JAK2/JAK2 0.95±0.07 0.61±0.05①0.43±0.04①②0.15±0.03①②③159.007 0.000

3 讨论

近年来，随着铂类化疗药物的普及、分子靶向药物的应用，膀胱癌患者总体生存率得到显著提高，精准靶向治疗成为热点研究领域[6-7]。但临床调查结果显示，膀胱癌术后复发转移风险较高，术后12 个月内复发率为10%～60%，预后生存期短[8]。膀胱癌属于尿路上皮细胞癌，病死率高。病灶转移和复发是导致膀胱癌患者死亡的重要原因。近年来研究显示，膀胱癌EMT 过程是复发转移的关键环节，膀胱上皮细胞在内外因素诱导下向间质细胞转化，该过程中细胞间黏附作用降低，癌细胞向远端侵袭和转移能力增强，最终导致病灶复发和转移[9]。表观遗传在膀胱癌发生、发展中发挥重要作用，EZH2基因是调控表观遗传的主要因子之一，参与组蛋白甲基化、EMT 等过程[10-11]。因此，抑制EZH2基因表达能抑制膀胱癌EMT 过程，从而为膀胱癌的治疗提供新的研究方向。

EZH2基因定位于人7 号染色体，编码746 个氨基酸，与果蝇E（z）蛋白的同源性为60.5%[12]。EZH2参与调控多种恶性肿瘤的进展。既往研究显示，EZH2 在结直肠正常黏膜组织、良性病变及腺癌中的阳性表达率依次升高，说明EZH2 参与结直肠癌变过程[13]。另有研究表明，EZH2 在肌层浸润性膀胱癌患者病灶中高表达，且与淋巴结转移关系密切，提示EZH2 可能参与膀胱癌EMT 过程，但仍需证据支持[14]。本研究首先通过检测EZH2 抑制剂GSK126 对膀胱癌活性的影响，结果显示，细胞培养24 h，GSK126 中、高剂量组细胞增殖能力均低于空白组；与空白组比较，GSK126 低、中、高剂量组细胞培养48 h、72 h 的细胞增殖能力及培养24 h 的穿膜细胞数、迁移率均降低，且具有剂量依赖性，提示抑制EZH2 可有效抑制T24 细胞增殖、侵袭和迁移能力，EZH2 与膀胱癌细胞活性密切相关。此外，本研究通过检测EMT 相关基因和蛋白的表达，结果发现，GSK126 各剂量组Vimentin、β-catenin mRNA 和蛋白相对表达量均低于空白组，E-cadherin mRNA 和蛋白相对表达量高于空白组，且均具有剂量依赖性，进一步证实抑制EZH2 可能抑制T24 细胞EMT 过程。Vimentin 属于细胞骨架蛋白，广泛分布于内皮细胞、淋巴细胞等间质细胞，是细胞EMT 的重要因子。有研究证实，Vimentin 参与肝癌细胞、肺泡上皮细胞等多种细胞EMT 过程[15-16]。β-catenin 是诱导EMT 的重要信号通路，未活化的β-catenin 与E-cadherin 结合，可维持上皮细胞形态及细胞间的黏附作用，当E-cadherin 表达被抑制，β-catenin 转入细胞质，在细胞质中不断累积，达到一定水平后转入细胞核，促进侵袭、迁移等靶基因的表达[17-18]。

此外，本研究发现，与空白组比较，GSK126 低、中、高剂量组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相对表达量均降低，且随GSK126 剂量升高而降低，提示EZH2 抑制剂可能通过抑制JAK2/STAT3 信号通路中JAK2 和STAT3 蛋白磷酸化，抑制膀胱癌T24 细胞EMT，且具有剂量依赖性。JAK2/STAT3 信号通路是细胞因子转导的关键通路，JAK2 可通过激活下游STAT 级联反应，调控癌细胞增殖、迁移等过程。既往有研究显示，抑制JAK2/STAT3 信号通路相关蛋白磷酸化可抑制胰腺癌[19]、肾细胞癌[20]的增殖和迁移，抑制肿瘤恶性生物学行为过程。因此，抑制特异性EZH2 表达能抑制膀胱癌EMT 过程，可能与抑制JAK2/STAT3 信号通路有关。

综上所述，本研究应用不同浓度EZH2 抑制剂均可抑制膀胱癌T24 细胞增殖、侵袭及迁移能力，且可有效抑制膀胱癌T24 细胞EMT 过程，其调控机制可能与抑制JAK2/STAT3 信号通路中JAK2 和STAT3蛋白磷酸化有关，可为临床膀胱癌的精准治疗提供更多思路。