脾虚湿阻型单纯性肥胖大鼠模型宏观证候、血生化、细胞免疫功能研究

刘芳芳 燕 平 王 平 张 耀 武丽萍 李 娟 张 赞 郭晓峰 陶功定 李俊莲*

1.山西中医药大学，山西 太原 030619；2.山西省中医院，山西 太原 030001

随着人们生活方式的改变，肥胖成为了全球日益严重的问题。根据WHO统计2015年全球成人已有23亿达到超重，7亿人口达到了肥胖标准[1]。中医学认为肥胖形成的原因主要与过食肥甘厚味，内伤脾胃，湿从内生有关。《素问·奇病论》曰:“必数食甘美而肥也。”《素问·通评虚实论》指出：“肥贵人，则膏粱之疾也。”单纯性肥胖症是现代社会中最常见的营养障碍性疾病，对于单纯性肥胖的中医证型可分为脾虚湿阻型、肝郁气滞型、阴虚内热型等多种[2]。目前临床最为常见的是脾虚湿阻型单纯性肥胖。本研究采用高脂饲料造成大鼠单纯性肥胖模型，通过观察记录单纯性肥胖大鼠一般情况、血清血脂、免疫指数的变化,探讨脾虚型单纯性肥胖模型大鼠体质量、宏观症候、血清生化指标、免疫指数等的影响。为建立脾虚湿阻型单纯性肥胖模型提供参考。

1 材料

1.1 实验动物 种类：雄性Spargue-Dawley(SD),成年健康大鼠40只,SPF级,体质量(200±20)g。来源：中国维通利华实验动物技术有限公司,许可证号SCXK(京)2016-0006。

1.2 实验仪器 流式细胞仪，美国BD公司。血生化分析仪BECKMAN COULTER AU5800；电子天平：奥豪斯仪器(常州)有限公司；低速离心机：盐城市安信实验仪器有限公司。

1.3 药物及试剂 含60% kcal%脂肪的高脂饲料。蛋白质：26.2 gm%；20 kcal%碳水化合物：26.3 gm%；脂肪：34.9 gm%。 40 kcal%型号：D12492蛋白质，购于中国维通利华实验动物技术有限公司。高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒 (苏食药监械生产许2001-0367)；低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒(苏食药监械生产许2001-0367)；甘油三酯测定试剂盒(GPO-POD法)(苏食药监械生产许2001-0367)；总胆固醇测定试剂盒(酶法)(苏食药监械生产许2001-0367)；FITC偶联抗大鼠的抗原CD3+抗体购于比欧联科供应链管理(北京)有限公司，货号:8051814；APC偶联抗大鼠的抗原CD4+抗体购于比欧联科供应链管理(北京)有限公司，货号:8108554；PE偶联抗大鼠的抗原CD8+抗体购于比欧联科供应链管理(北京)有限公司，货号:8116845。

2 实验方法

2.1 实验动物模型的制作 单纯性肥胖模型制作文献[3]，雄性SD大鼠40只,重量为(200±20)g,4～6周龄，每笼5只。适应性饲养1周后，随机分为对照组10只(普通饲料喂养)与单纯性肥胖模型组30只(高脂饲料喂养)。高脂饲料喂养8周后，大鼠体重超过普通饲料喂养大鼠体重 20%作为实验性营养肥胖大鼠，设为单纯性肥胖大鼠组。

2.2 观察项目 于造模前、后每日上午9：00定时称量大鼠的体质量、进食量、饮水量,并记录。每日观察记录每组大鼠的精神状况、活动情况、毛色光泽度、皮肤黏膜及排泄物性状,对宏观症候评定计分。

将鉴定为造模成功的大鼠腹主动脉取血，装入离心管中，离心机离心，取上清液，倒入尖管内。血清、血脂四项生化分析。取脾组织，脾组织流式细胞检测。

2.3 两组大鼠免疫指标(脾细胞CD3+、CD4+、CD8+含量) 操作步骤：①取两组大鼠脾脏，每组大鼠脾脏分别放置在5 mL无菌小烧杯中，先用无菌的玻璃注射器内塞轻轻研磨脾组织，研磨至脾组织成糊状，加入适量无菌PBS液后，用无菌吸管反复进行吹打至均匀，使用漏斗将脾细胞混悬液在200目筛网中过滤后，进入10 mL无菌离心管中，将离心管平衡放入离心机中以1000 r/min，离心5 min；②倒掉上清液，分别加入CD3+、CD4+、CD8+抗体各10 μL混合液，4 ℃避光孵育20 min，行表面染色； ③配制工作液Ⅰ(洗涤液)：20次test[5X Perm/wash Buffer∶双蒸水=1∶4]使用前先摇晃原液；④在两组大鼠脾细胞1 mL混悬液中，分别加入2 mL工作液Ⅰ，1000 r/min,离心5 min；⑤配制工作液Ⅱ(破膜剂)：20次test[4X Fix/perm∶TF Diluent Buffer=1∶3]使用前请摇晃原液；⑥倒掉上清液，观察细胞裂解程度，如有离心管内有絮状物，则分别加入1 mL工作液Ⅱ混匀，4 ℃下避光孵育5 min；⑦分别加洗涤液1 mL，摇匀，1000 r/min，离心5 min，重复1次；⑧分别加入2 mL PBS洗涤液，震荡混匀，1000 r/min，离心5 min,重复1次。加入200 ulPBS洗涤液;⑨分别加入2 mL流式染色缓冲液重悬细胞。将两组细胞上流式细胞仪进行检测，CELLQuest下获取信号并分析。

3 结果

3.1 实验大鼠实验前体质量的比较 本实验大鼠随机分为对照组10只、单纯性肥胖模型组30只,两组间动物实验前(适应性饲养7 d后)体质量的比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 实验前各组大鼠体质量的比较

3.2 实验大鼠体质量的变化 造模前,两组间实验大鼠体质量的比较差异无统计学意义(P>0.05), 单纯性肥胖模型造模2周后单纯性肥胖模型组大鼠体质量(351.77±20.56)较对照组(396.49±23.96)显著升高(P<0.01)。单纯性肥胖模型造模7周后单纯性肥胖模型组大鼠体质量(539.22±40.15)较对照组(593.11±55.52)显著升高(P<0.01)。单纯性肥胖模型造模8周后单纯性肥胖模型组大鼠体质量(606.85±54.06)较对照组(538.39±37.67)显著升高(P<0.01)。见表2。

表2 造模期间2、4、6、7、8周两组大鼠体质量的变化

3.3 大鼠宏观证候表现 实验前,各组大鼠精神状态良好、活泼好动、皮毛光泽度好、皮肤黏膜红润、球形粪便干稀适中，逃避、反抗、咬人正常。

单纯性肥胖模型组大鼠造模2周后个别大鼠出现抹嘴，瘙痒。3周后出现饮水量减少，鼠尾脱皮掉毛，多数大鼠出现抹嘴，瘙痒。4周后个别抹嘴，坐姿有变化，挺肚子坐；个别鼠尾脱皮；逐渐出现粪便软、不成形,个别大鼠粪便甚至稀溏。在造模过程中，大鼠逐渐出现精神萎靡不振,扎堆,嗜睡,反应迟钝,行动迟缓,毛色枯槁, 抓取时叫声比较温柔，情绪平稳，尾皮鳞屑状脱落，舌淡胖。逃避、反抗表现不灵敏，行动较迟缓。

3.4 实验大鼠血清血脂四项生化分析 脾虚湿阻型单纯性肥胖模型组大鼠血清血脂四项生化分析较对照组无显著变化(P>0.05)。见表3。

表3 造模期间各组大鼠血清血脂四项生化分析

3.5 实验大鼠脾组织流式细胞术分析 单纯性肥胖模型组大鼠脾组织流式细胞术分析，所有淋巴细胞中CD3+、CD4+所占比率(20.79±1.96)较对照组(31.66±0.83)显著降低(P<0.01)。所有淋巴细胞中CD3+、CD8+所占比率(31.27±1.65)较对照组(27.00±1.72)显著升高(P<0.01)。见表4、如图1所示。

表4 两组大鼠CD3+、CD4+、CD8+T细胞表达情况

4 讨论

本课题通过建立与人类高脂饮食结构相类似、肥胖相关指标明确的营养性肥胖大鼠模型，以传统中医基础理论为依据，符合单纯性肥胖病脾失健运，痰湿内停的病机。脾为后天之本，其气主升，喜燥恶湿，脾主运化，主肌肉四肢，为气血生化之源，是生命的动力源头。当脾脏功能正常时，可以将机体摄入的饮食水谷转化为精微物质，将其吸收并传输布散到全身，以维持人体正常的生理活动。脂肪的摄入过量，导致脾失健运，脾受湿困故出现大鼠进食量减少，体重减轻，喜蜷卧扎堆。脾气虚弱，“升清”功能减弱，不能将水谷精微物质上输于肺及头目，则表现为精神萎靡，倦怠嗜卧。

中医学认为机体各功能的正常运行及人体的适应能力、防御能力和康复能力主要有赖于人体正气的旺盛。中医经典著作《黄帝内经·素问·刺法论》曰：“正气存内，邪不可干。”即正气充盛，机体足以抵抗邪气，不易发生疾病；反之“邪之所凑，其气必虚”，当正气不足，邪气趁虚而入，往往会引起机体阴阳失调，从而产生疾病。当机体免疫功能下降时，会出现亚健康状态，如湿邪停滞体内导致单纯性肥胖的发病。湿邪阻滞气机，会出现倦怠乏力，机体的活动度、灵活度下降。正气存内可预防湿、痰等有形实邪的产生,上述正气之效力与人体免疫系统有异曲同工之处。任何疾病的发生，都必然是脏腑、经络、气血功能的失调，病程久延，还会导致脏腑、经络、气血的损伤，即正气亏虚；免疫功能是正气的重要方面，即抗病能力，当人体免疫功能受损时,容易受到邪气的侵袭而致病。

细胞免疫是机体抗外界免疫的主要手段，细胞免疫中T淋巴细胞在机体抗肿瘤免疫中起调控及免疫监视作用。调节性T细胞最近几年来研究比较多，在机体内起到免疫调节作用的T细胞亚群，对人体机体的免疫平衡状态的维持起了重要作用,其数量或功能的异常往往与多种自身免疫病的发生发展相关。目前认为Tregs主要有CD4+Treg和CD8+Treg等亚群，CD4+Treg细胞,在维持机体自身耐受和调控免疫应答水平中起重要作用[4-6]。CD4+Th1细胞也可分泌白细胞介素2 (Interleukin 2, IL-2)和γ干扰素 (Interferon γ, IFN-γ)，参与调节细胞免疫,辅助细胞毒性T淋巴细胞分化,介导细胞免疫应答[7]。CD8+T淋巴细胞又称为细胞毒细胞，起免疫抑制作用，可以杀伤受感染的细胞，包括被HIV等病毒感染的CD4+T淋巴细胞[8-9]。正常状态下，人体中 CD4+/CD8+的比值保持平衡，免疫功能相对比较稳定[10]。对照组的脾细胞的免疫功能：在整个淋巴细胞中，CD3+与CD4+所占的比率为(31.66±0.83)%，CD3+与CD8+所占的比率为(20.79±1.96)%，单纯性肥胖模型组脾细胞的免疫功能：CD3+与CD4+所占的比率为(27.00±1.72)%，CD3+与CD8+所占的比率为31.35%。单纯性肥胖模型组脾细胞的免疫功能： CD3+与CD4+所占的比率为27.27%，CD3+与CD8+所占的比率为(31.27±1.65)%。单纯性肥胖模型组CD3+与CD4+在整个淋巴细胞中所占的比率降低，CD3+与CD8+在整个淋巴细胞中所占的比率增高，由此提示单纯性肥胖模型的大鼠的免疫功能受到很大影响。

研究结果显示,造模前各组大鼠体质量差异无统计学意义。单纯性肥胖模型组造模后,大鼠体质量明显增加20%以上,与对照组比较有显著差异。脾虚湿阻型单纯性肥胖大鼠的一般情况包括体质量、精神状态、饮水量、活动状态、排泄物性状等都较对照组有明显改变。说明饮食自倍，肠胃乃伤。尤其是脾主运化水谷功能的失常。然而与对照组相比，单纯性肥胖模型组血清血脂四项生化分析(包括总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白)没有显著变化(P>0.05)。说明在体重增加后，短时间内血清血脂不会发生显著变化。这也是临床单纯性肥胖病人血清生化指标检测正常的原因，此时已是亚健康状态，但血清生化指标尚未有大的变化的实验依据。但造模成功后，免疫指标发生了显著变化，单纯性肥胖机体抵抗力明显下降，说明免疫指标较血清生化指标更早提示机体病理状态。