通塞宣肺合剂对博来霉素诱导的肺纤维化的防治作用研究

张 帅 黄思诗 张荣昶 龚小妹

1.防城港市中医医院,广西 防城港 538021；2.广西卫生职业技术学院，广西 南宁 530000；3.广西药用植物园,广西 南宁 530000

肺纤维化(Pulmonary fibrosis，PF)是现代医学面临的治疗难题，作为慢性复杂类疾病之一，发病率和致死率都较高，其发病机制并不清楚，好发于中老年，生存周期短，生存质量低[1-2]。目前对于肺纤维化最有效的方法就是肺移植，但是肺移植手术价格昂贵，肺供体稀缺，在临床上推广使用较少。临床实践和现代试验表明中医药对防治肺纤维化具有一定的优势，可以改善患者的生活质量。中医将肺纤维化归于“肺痿”“肺痹”“肺胀”等范畴[3-5]。中医认为肺间质纤维化主要发病机制是气虚血瘀、痰热互结痹阻肺络。通塞宣肺合剂由牛大力、黄芪、三七、芒果叶组成。牛大力、黄芪性温而味甘，归肺、脾、肾经，具有补气润肺之效；三七活血化瘀，芒果叶清热祛痰止咳，全方共奏补肺益肾，止咳祛痰，活血化瘀之功。现代研究[6-7]表明黄芪、三七、芒果叶对肺纤维化都有一定的干预作用。本研究通过观察通塞宣肺合剂对博来霉素诱导的肺纤维化的炎症因子影响，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6～8周龄昆明种雄性小鼠，体重18～22 g，购自广西医科大学实验动物中心。合格证号：scxk桂2016-0002。

1.2 药物与试剂 注射用盐酸博莱霉素(批号：210082，日本化药株式会社)；乙醚(批号：ws20050411，国药集团化学试剂有限公司)；黄芪(批号：130901)、三七(批号130902)、芒果叶(自采)经广西中医药大学中药教研室覃文慧鉴定为正品。盐酸(成都科龙化学试剂有限公司)；冰乙酸(AR)(上海国药集团化学试剂有限公司)；地塞米松磷酸钠注射液(批号：130608，广州白云山天心制药股份有限公司)。羟脯氨酸(HYP)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；IL-4、TNF-α试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 仪器 BX60显微镜(OLYMPUS)、TGL-16B和TGL-16C型高速台式离心机、高速低温离心机(Heraeus LG16-W)、全波长酶标仪(Epoch Biotek公司)、TU-1901/1900 紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)、EL204电子天平( 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)、GZX-DH·400型电热恒干燥箱(上海跃进公司)、HH·B11·360型电热恒温培养箱(上海跃进公司)、BX-60型研究级显微镜(OLYMPUS )、YQ-3匀浆器；德国Leitz1512型石蜡切片机；病理图像分析仪(德国Leica公司)。

1.4 造模与分组 取6～8周健康昆明种雄性小鼠48只，随机分为6组，每组8只，空白组(生理盐水)、模型组(生理盐水)、阳性组(地塞米松)、通塞宣肺合剂制剂高剂量组、通塞宣肺合剂制剂中剂量组、通塞宣肺合剂制剂低剂量组。各组小鼠乙醚麻醉后，仰位固定，用手托住小鼠呈直立状，配合小鼠呼吸，从鼻腔缓慢滴入无菌盐酸博莱霉素溶液(6 mg/kg)，空白组滴入等量无菌生理盐水，滴完后保持直立20 s，连续观察14 d，小鼠出现咳嗽、乏力、冷颤现象，模型即建立完成。

1.5 实验给药 各组于造模14 d后开始相应的药物干预，空白组和模型组采用生理盐水(NS)灌胃，阳性组给予地塞米松(1 mg/kg)灌胃，其余各组每天分别给予通塞宣肺合剂高剂量组(5.00 mg/kg)、通塞宣肺合剂中剂量组(3.30 mg/kg)、通塞宣肺合剂低剂量组(1.65 mg/kg)灌胃。

1.6 观察指标 各组小鼠分别于造模后第28天采集标本摘眼球取血后静置析出血清后，于4 ℃离心机以3000 rpm离心10 min，分离血清，-80 ℃冰箱保存备测定指标用。打开小鼠胸腔，取出左侧肺组织保存至-80 ℃冰箱，分别用 ELISA法检测肺组织中白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)和肿瘤坏死因子(TNF-α)含量水平，碱水解法测定肺组织中羟脯氨酸(HYP)的含量。操作按照试剂盒操作说明书进行。

肺右大叶固定于4%多聚甲醛溶液中，常规石蜡处理，分别用HE和Masson染色观察肺组织病理改变以及肺纤维化程度。HE染色病理切片(Szapiel方法)分为4级。I级(0分)：无肺泡炎症；II级(1分)：轻度肺泡炎症，单核细胞浸润使肺泡隔增宽，仅限于局部和近胸膜部，面积小于全肺的30%，肺泡结构一般正常；III级(2～3分)：中度肺泡炎症，受累面积占全肺的30%～70%，近胸膜部比较严重；IV级(4分)：重度肺泡炎症，受累面积大于70%，偶然会见到肺泡腔内有单核细胞和出血造成的实质性变化。

Masson染色病理切片，将肺纤维化程度分4级。I级(0分)：无肺纤维化；II级(1分)：轻度肺纤维化，受累面积小于20%；III级(2分)：中度肺纤维化，受累面积占全肺的20%～50%；IV级(3分)：重度肺纤维化，受累面积大于50%，肺泡结构比较紊乱。

2 结果

2.1 小鼠一般状况 空白组小鼠皮毛健康无松散，具光泽，体重逐渐增加，呼吸平稳，未有咳嗽现象；模型组小鼠刚刚造模后会出现挠头、躁动不安现象，随着实验的进行，体重会下降；精神萎靡不振；毛发松散，无光泽；呼吸困难、急促，偶有喘鸣声，多有咳嗽；用药组小鼠的一般状况较模型组好。与空白组小鼠比较，模型组体重下降相对比较明显(P<0.01)，其余各组小鼠的体重均呈现出了不同程度的减轻；阳性组、通塞宣肺合剂高剂量组小鼠体重较模型组增加(P<0.05)。见表1、图1。

表1 各组小鼠 体重比较

2.2 各组小鼠肺组织中HYP、IL-4 、IL-10、TNF-α的含量 通塞宣肺合剂高剂量组小鼠HYP、IL-4、TNF-α的表达水平显著性地降低(P<0.01)，中、低剂量组有所降低(P<0.05)；IL-10含量表达显著性的增高(P<0.01)，中、低剂量组有一定的效果(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠肺组织中HYP、IL-4 、IL-10、TNF-α水平比较

2.3 各组小鼠肺组织中TGF-β1mRNA的表达水平 通塞宣肺合剂高剂量组小鼠TGF-β1mRNA的表达水平显著性地降低(P<0.0 1)，中、低剂量组有所降低(P<0.05)，低剂量组有一定的效果(P<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠肺组织中TGF-β1mRNA的表达水平

2.4 各组小鼠肺组织病理形态学观察 光学显微镜下观察，对照组肺结构清晰，肺泡上皮细胞、肺间质血管上皮细胞未见或少见炎症细胞浸润，支气管、肺泡、血管壁均未见胶原纤维明显增生；肺泡炎症与肺纤维化程度评分均为0分；模型组小鼠均有肺泡炎，表现为肺泡充血、水肿，部分肺泡有透明膜形成，肺泡上皮细胞有中至重度损伤，肺泡炎稍减轻；肺纤维化程度最重，多呈III级肺纤维化变化，胶原纤维组织增生、变厚，肺气肿严重；肺泡炎症与肺纤维化程度评分均为3分，与对照组比较，差异显著(P<0.01)。各给药组肺泡炎症与肺纤维化程度均有明显的改善，评分均为2分，与模型组比较，差异显著(P<0.01)。肺组织病理学分析结果如图1、图2和表4所示。

表4 各组小鼠肺泡炎症、肺纤维化程度比较

3 讨论

肺纤维发病机理复杂，临床对肺纤维化的治疗仍然是一个难题，中药复方对防治肺纤维化具有一定的优势。通塞宣肺合剂是按照肺纤维化气虚、血瘀、痰热的机理组成的经验用方，由牛大力、黄芪、三七、芒果叶组成，牛大力、黄芪性温而味甘，归肺、脾、肾经，具有补气润肺之效；三七活血化瘀，芒果叶清热祛痰止咳，全方共奏补肺益肾，止咳祛痰，活血化瘀之功。

肺纤维化是由于细胞外基质和成纤维细胞过度沉积而导致肺组织结构异常修复的一类疾病[8-9]。胶原蛋白是细胞外基质的主要有形成分，肺内结缔组织的成分绝大部分是胶原，它分布于肺泡壁、支气管、胸膜和血管等所有肺组织中，因此胶原的异常沉积是肺纤维化的标志性改变[10]。肺纤维化中由于细菌、病毒等多种致病因素的作用，导致肺泡炎症细胞分泌多种生物活性物质，诱导纤维母细胞合成、分泌大量的胶原成分，使得肺中胶原的合成速度大于降解速度，胶原纤维明显增多，从而导致胶原的逐渐积累，以上构成了肺纤维化的病理学基础[11]。而 HYP 是胶原中的一种特有的氨基酸，在胶原蛋白中含量约占 13%～14%，在弹性蛋白中占极少量，在其它蛋白中则不存在，因此当胶原代谢发生异常时，组织内 HYP 含量发生相应的变化，在胶原蛋白水平检测方面，HYP的含量可作为特异性的判断纤维化程度的指标[12-13]。

TNF-α是TH1细胞分泌的促炎症因子，可加速中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的增殖， 加速炎症反应，加快肺纤维化的形成；TNF-α还能促进IL- 4的生成，激活成纤维细胞[14-16]。实验结果表明，通塞宣肺合剂能够降低IL-4的含量，同时减少IL-10的水平，与模型组比较具有统计学意义(P<0.01)。通过对各组小鼠一般状态观察分析，用药组小鼠体重、精神状态；毛发光泽和组织切片观察HE染色、Masson染色观察；呼吸状况等方面较模型组好，从整体上反映出通塞宣肺合剂对肺纤维化小鼠有一定的治疗作用。表明了通塞宣肺合剂能在一定程度地抑制炎性细胞浸润，抑制胶原纤维的沉积，从而起到了防治肺间质纤维化的作用，缩短了病变的进程，可以用于阻逆早期纤维化。