三角梅开花早期不同分化时期的激素水平与相关性分析

罗 颀，林 哲，黄政档，侯海涛，陈自亮，洪陈洁，詹福麟，郭杭琪，许婷婷，郭小玲，陈 亮，纪志梁*

(1.厦门市公路事业发展中心，福建 厦门 361008；2.厦门大学生命科学学院，福建 厦门 361102；3.厦门万银环境科技有限公司，福建 厦门 361006；4.厦门大学环境与生态学院，福建 厦门 361102)

三角梅(Bougainvilleaspectabiliswind)隶属被子植物(Angiosperms)真双子叶植物(Eudicots)石竹目(Caryophyllales)紫茉莉科(Nyctaginaceae)叶子花属(Bougainvillea)攀援型灌木，作为一种热带和亚热带常见的观赏植物，在世界各地被广泛种植[1].在生产实践中，养护技术人员希望能够精准调控三角梅在特定的时间节点开花并延长花期，但迄今国内外对三角梅开花机制的了解较为有限.

三角梅成花过程具备被子植物开花的共性，即花芽分化表征被子植物由营养生长转向生殖生长[2-4].目前对于三角梅成花过程的具体分期国内外并未有一致的结论.在前期研究中，邱胤晖[5]和田高飞[5-6]根据各阶段花芽形态分化的特征，将三角梅的开花过程分为7个时期，即未分化期、分化初期、苞片原基分化期、小花原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期.而聂艳等[7]根据对三角梅花芽的解剖结果，将花芽分化过程分为未分化期、花序原基形成期、苞片原基形成期、小花原基形成期、萼片原基形成期、花瓣原基形成期、雌雄蕊原基形成期7个时期[7].Lopez等[8]对三角梅的花序结构以及成花过程进行了形态学的分类描述，将三角梅花的生命周期分为未命名的5个阶段.Hackett等[9]则通过对三角梅的花序原体解剖来阐述三角梅花芽分化过程中的形态变化，并以芽的形状和大小为特征，将花序的发育分为13个花芽发育阶段和3个花期阶段.

在三角梅的成花分子机制方面，国内外已经开展了一些研究.多数工作以拟南芥(Arabidopsisthaliana)为参考，发现一些已知被子植物成花相关基因在三角梅中的同源基因，包括APETALA1(AP1)、LEAFY(LFY)、CONSTANS(CO)和类黄酮-3′-羟化酶(F3H)等[5]；但整体而言，三角梅的成花研究还处于初级阶段.一方面，许多已知被子植物成花相关基因还未在三角梅中被阐明；另一方面，已知成花基因未能被很好地关联起来，以系统阐明三角梅的成花分子机制.此外，内源性植物激素，如脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)和吲哚乙酸(IAA)等，在植物的开花过程中也发挥着重要作用.它们在植物体内的平衡状况是植物营养生长和生殖生长的基础，也是开花的诱导条件.通过调节这些植物激素的平衡状态，可以实现植物营养生长和生殖生长的转换[10-11].陈庭巧等[12]和聂艳[13]研究发现，外源植物激素或植物生长调节剂可引起植株原有内源激素相对比例的改变，干扰植物内源激素的稳态平衡，从而达到调控开花的目的.在生产实践中，通过单一或组合喷洒GA、ABA和矮壮素(CCC)等化学手段可在一定程度上实现对三角梅的花期调控[14-15]；但由于缺乏对三角梅成花机制，尤其是成花早期各激素表达情况的深入了解，化学干预三角梅开花的效率不高，甚至出现反效果[16].因此，本研究拟跟踪三角梅顶端和侧端成花过程中多种常见植物激素的变化情况，发掘可能参与三角梅成花过程的植物激素，并分析能特异促进三角梅顶端和侧端成花的激素组合，以期为将来生产实践中精准调控三角梅成花提供科学参考.

1 材料与方法

1.1 生物样本的采集与预处理

本研究选取三角梅品种同安红(Miss Manila)作为研究对象.样本采集时间为2018年10月，处于正常花期；采样地点为厦门万银环境科技有限公司三角梅栽培基地.为了消除植株批次、生长养护环境、植物个体及采样部位差异所导致的激素水平差异，选取同一生长批次的4株4年生盆栽三角梅，在同一时间段内采集不同植株、不同枝杈的样品.参考既往研究，根据花芽分化各阶段的形态学和解剖学特征，将三角梅成花早期分为以下3个阶段：未分化期(刺或叶芽)、分化初期(花刺或花芽)和分化后期(小花苞).采集的组织器官样本按照采集部位分为3组：以非开花部位小叶作为对照组；侧端开花组系经叶腋处侧端的刺发育开花，包括刺、花刺和小花苞；顶端开花组系顶芽发育开花，包括叶芽、花芽和小花苞.由于独立样本较小难以直接开展可靠的激素测定，将同一形态时期采集的样本混合，并随机分为2个生物学重复.样本采集后，在现场用双蒸水(ddH2O)充分冲洗样本，经干净滤纸充分干燥后，立即用锡箔纸包裹标记，液氮冻存.

1.2 植物激素测定

1.2.1 标准曲线

测定生物样本中19种常见植物内源激素及其合成前体的水平，包括GA1、GA3、GA4、GA7、茉莉酸(JA)、异亮氨酸化茉莉酸(JA-Ile)、顺式12-氧-植物二烯酸(cis-OPDA)、ABA、水杨酸(SA)、反式玉米素(tZ)、二氢玉米素(DHZ)、反式玉米素核苷(tzR)、异戊烯基腺嘌呤核苷(iPR)、异戊烯基腺嘌呤(iP)、油菜素内酯(BL)、油菜素甾酮(CS)、香蒲甾醇(TY)、1-氨基-环丙烷羧酸(ACC)和IAA.将19种激素的标准品溶于甲醇水溶液(Merck公司，144282)，并稀释为系列浓度的标准工作溶液，采用同位素内标法建立标准曲线.所有标准品均购自Olchemim公司.

1.2.2 代谢物提取

将样品于液氮中研磨成粉末，称取(80±3)mg，置于2 mL离心管中，加入50 μL内标溶液，加入1 mL含1%(体积分数)甲酸(Fluka公司，06450)的乙腈(Merck公司，1499230-935)，震荡混匀2 min；4 ℃避光抽提12 h，14 000g离心10 min，取上清液800 μL，氮气吹干；用100 μL乙腈水溶液(乙腈与水的体积比1∶1)复溶，14 000g离心10 min，取上清通过液相色谱-质谱(LC-MS)联用进行植物激素的测定分析.

1.2.3 LC-MS联用测定

待测样本首先采用Waters Ⅰ-Class超高效液相色谱系统进行物质分离.分离流动相的A液为 0.05%(体积分数)甲酸水溶液，B液为0.05%(体积分数)甲酸乙腈溶液.样品置于4 ℃自动进样器中，柱温45 ℃，流速400 μL/min，进样量2 μL.相关的液相梯度如下：0～10.0 min，B液从2%(体积分数，下同)线性变化至98%；10.0～11.1 min，B液从98%线性变化至2%；11.1～13.0 min，B液维持在2%.分离样本接着采用5500 QTRAP质谱仪(AB SCIEX公司)在正/负离子模式下进行质谱分析.5500 QTRAP电喷雾离子源条件如下：源温度 500 ℃，离子源气体1(Gas1)45，离子源气体2(Gas2)45，幕帘气体(CUR)30，离子喷雾电压(ISVF)-4 500 V；采用质谱多反应监测(MRM)技术测定离子对.

1.2.4 样本分析

将所有激素标准样等量混合制备成为质控(QC)样本.在待测生物样本队列中每间隔一定数量的实验样本设置一个QC样本，用于检测和评价系统的稳定性和重复性.混合样本队按标准操作流程通过LC-MS联用测定激素水平.3次重复测定QC样本各激素水平的相对标准方差(RSD)均<30%，说明实验数据稳定可靠.样本激素测定结果采用Multiquant软件提取色谱峰面积及保留时间，并根据标准曲线计算样品中植物激素水平.对两次生物学重复样本的各激素水平进行单因素方差分析，结果显示两次重复样间不存在显著差异(H0假设，p>0.1).因此，采用两次重复样的检测均值作为各形态时期样本的激素水平值.

1.3 激素水平变异系数和相关性分析

1.3.1 激素水平变异系数计算

基于顶端和侧端两个成花路径样本组中19种内源激素水平的变化情况，对测得的激素含量取5为底的对数进行归一化处理，采用热图的形式衡量激素在成花过程中的变化趋势.同时，为了消除不同激素含量本底水平不同带来的影响，不直接使用标准差(SD)，而通过计算变异系数(CV)来衡量开花样本组内激素水平在三角梅成花不同阶段的差异程度.CV=SD/平均值.CV值越接近于0，表明激素在不同时期的水平差异越小；反之，则表明水平差异越大.通常情况下，CV>0.15即被认为水平差异较大[17].本研究以CV>0.3为标准判断变化显著的激素，同时采用R语言包的aov函数对每个样本组各激素在不同组织中的水平变化进行单因素方差分析.

1.3.2 激素水平变化间的相关性分析

根据三角梅在成花过程中的激素含量，采用R语言包的corrplot包分别分析三角梅顶端成花和侧端成花中各激素水平变化间的相关性.网络图能够简洁、直观地反映出激素之间的相互作用关系，特别是能够通过自身的拓扑结构突显出某些核心的关键激素.因此，采用Cytoscape软件，选取相关系数大于0.6的激素构建激素间相互作用网络；进而通过CytoHubba工具(Method：MNC)找出节点激素，并将激素按总关联度大小进行排序.

2 结果与分析

2.1 三角梅成花过程激素水平的整体变化

如图1所示，19种植物内源激素的含量水平在所有样本中整体呈阶梯状分布，其中，cis-OPDA、SA和GA7的水平较其他激素高约2个数量级(102).如表1所示：在成花组织中，尤其是侧端成花路径中，上述3种激素水平发生显著变化(CV>0.3,p<0.05)，提示它们在成花中可能发挥重要作用；与之相对，BL、iP、JA和JA-Ile(表中未列出)在所有样本中均稳定处于低水平(在LC-MS中检测均低于1 ng/g)，且在各成花过程未发生显著水平变化(CV<0.1，p>0.05)，提示这4种激素对三角梅成花无明显调控作用；其余的12种激素整体处于相对较低的水平，除TY在成花过程中保持基本水平稳定外(CV<0.1)，多数激素或前体在成花的不同阶段均发生显著变化.在侧端成花中，水平差异较大(CV>0.3)的激素包括GA7、GA4、tZ、GA1、CS、ACC、tzR、ABA和cis-OPDA；在顶端成花中，水平差异较大的激素包括GA4、GA7、DHZ、SA、CS和GA1.值得一提的是，虽然cis-OPDA在顶端成花中CV值仅0.14(表1)，但是其在各组织中的水平较其他激素普遍高约2个数量级(图1)，且在花芽分化(叶芽→花芽)过程中水平升高约30%(见后文)，因此也将cis-OPDA作为水平差异较大的激素纳入后续激素相互作用的分析中.

c为测定的激素相对水平.

表1 三角梅成花过程中内源激素水平变化的统计分析

2.2 与三角梅成花关联的激素变化

分析三角梅成花不同阶段内源激素的变化趋势，如表2所示：在侧端成花中，水平差异较大的9种激素除GA1外，在刺→花刺分化阶段均显示为上升的变化趋势，其中tZ的上升幅度最大，达1 705%；在花刺→小花苞的阶段，GA1、GA4、GA7、cis-OPDA和tZ略有下降，其他激素则没有明显变化.在顶端成花中，水平差异较大的6种激素变化差异明显.在叶芽→花芽分化阶段，GA7、cis-OPDA、DHZ和CS变化趋势显示为上升的变化趋势，其中CS的上升幅度最大，达215%；而GA1、GA4和SA则显示为下降的变化趋势.在花芽→小花苞分化阶段，除CS上升29%外，其他激素均为下降的变化趋势.

表2 三角梅成花不同阶段内源激素水平的变化幅度

高表达水平激素GA7、cis-OPDA、ABA和tzR在三角梅侧端成花不同阶段差异大且显著(CV>0.3且p<0.01)，可能主要参与成花调控；而GA4、tZ、DHZ、CS和ACC虽在三角梅早期花芽分化(刺→花刺)过程中水平明显变化(幅度>50%)但不十分显著(p>0.01)，可能部分参与早期成花过程.其中，GA4、GA7、cis-OPDA、ABA、tZ、、DHZ、tzR、CS和ACC均在刺→花刺分化过程中水平上升，它们可能促进三角梅花芽分化；而在花刺→小花苞分化过程中GA4和GA7则发生明显下降(幅度>50%)，暗示其在三角梅花芽分化的中后期可能不参与调控或起抑制作用.

高表达水平激素GA7和SA在三角梅顶端成花不同阶段差异大且显著(CV>0.3且p<0.01)，可能主要参与成花调控；而GA4、tZ、DHZ、tzR和CS的水平在叶芽→花芽分化过程中均发生明显变化(幅度>50%)但不十分显著(p>0.01)；高表达水平激素cis-OPDA变化幅度达30%且极显著(p=0.001)，可能部分参与早期成花过程.其中，GA7、cis-OPDA、tZ、DHZ、tzR和CS在叶芽→花芽分化过程中水平上升，它们可能促进早期花芽分化；而GA4和SA则明显下降(幅度>50%)，可能抑制早期花芽分化.在花芽→小花苞分化过程中，仅GA7发生明显下降(幅度>50%)，暗示GA7可能不参与三角梅花芽中后期分化调控或起抑制作用.

2.3 三角梅成花过程中激素间的相互作用

对10种可能参与三角梅成花过程的内源激素水平变化进行相关性分析(图2)，建立可能存在的相互作用网络(图3)，并尝试确定其中的关键激素.在侧端成花过程中，9种激素根据相关程度聚成2个小群(图2(a))：GA4、DHZ、tZ、GA7和cis-OPDA聚为一类，两两之间的相关系数均高于0.85，在花芽分化的过程中其水平均显示为先升高后下降的变化趋势；ABA、CS、tzR和ACC聚为一类，两两之间的相关系数均为1，水平在刺→花刺分化阶段明显升高，随后在花刺→小花苞分化阶段无明显变化.进一步相互作用网络分析揭示cis-OPDA、tZ和GA7为节点激素，可能在成花的不同阶段扮演关键角色.所有在侧端成花组中发生显著变化的激素均为正相关，这些重要激素水平的升高可能促进三角梅的花芽分化，随后水平下降或趋于稳定，花芽分化进入中后期.

圆的大小、颜色深浅与相关系数的绝对值成正比.

圆的大小与激素水平呈正相关，圆的颜色深浅与总关联度呈正相关，粗框圆表示节点激素；连接线的粗细与激素间的相关程度呈正相关，红色为正相关，蓝色为负相关.(圆的大小、颜色、连接线粗细仅在同一图内比较)

在顶端成花过程中水平显著变化的7种激素根据相关程度聚成3个小群(图2(b))：tZ和CS聚为一类，两者的相关系数为0.85，在叶芽→花芽分化阶段水平均为上升的变化趋势；GA4和SA聚为一类，两者的相关系数为0.99，在花芽分化不同阶段水平都显示为下降的变化趋势，且与CS的水平呈明显负相关；GA7、cis-OPDA和DHZ聚为一类，两两之间的相关系数均高于0.60，三者在叶芽→花芽分化阶段水平均明显升高，随后在花芽→小花苞分化阶段呈现下降的变化趋势.进一步相互作用网络分析揭示tZ、cis-OPDA和GA4为节点激素，其中tZ和GA4呈高度负相关，可能存在相互抑制的关系(图3(b)).在叶芽→花芽分化过程中，DHZ水平的迅速升高以及cis-OPDA和GA7的高水平可能促进三角梅的花芽分化，随后这些激素水平均下降，花芽分化进入中后期.

3 讨论与结论

通过对19种植物内源激素在三角梅成花不同阶段的水平检测和统计学分析，发现GA4、GA7、cis-OPDA、ABA、SA、tZ、DHZ、tzR、CS和ACC的激素水平在三角梅花芽分化的主要过程(刺→花刺→小花苞、叶芽→花芽→小花苞)中发生不同程度的变化，可能参与三角梅成花早期调控，其中GA7、cis-OPDA、GA4和tZ可能作为节点激素在发挥关键作用.

3.1 不同激素参与三角梅成花过程与其他植物的异同

不同的植物激素在植物成花过程中扮演迥异的调控角色.在生产实践中，外源GA可以调节百子莲(Agapanthusafricanus)花茎的伸长和提早成花[18]，提高蝴蝶兰(Phalaenopsisaphrodite)抽薹率并提早花期[19]，促进羊草花(Leymuschinensis)芽分化和成花[20]；然而在木本果树中，GA则是成花的主要抑制激素，如Zhang等[21]研究表明GA3对苹果(Malusdomestica)花的诱导有一定的延迟作用.本研究发现GA家族的4个成员在三角梅成花早期分化阶段的水平表现有差异:其中，GA1和GA3在三角梅整个成花早期水平变化相对GA4和GA7较小且不显著，可能不参与三角梅成花过程；而GA4和GA7的水平在刺→花刺分化过程中升高幅度分别达610%和1 388%，尤其是GA7在三角梅花芽分化的不同阶段都保持较高水平，说明高水平的GA4和GA7对三角梅成花可能具有促进作用.cis-OPDA是合成JA和JA-Ile的前体，JA在拟南芥中被认为参与植物成花调控，并具有调控成花时间的作用[22].本研究中，cis-OPDA水平高，而JA和JA-Ile水平较低，该结果与陈康等[23]在人参(Panaxginseng)花中的研究结果相似.由于激素本身具有级联放大的作用效果，高浓度的cis-OPDA可为诱导大量JA信号提供物质基础，而JA和JA-Ile本身维持较低的浓度才是常态.tzR可促进细胞分裂，调控花形态建成中的物质和能量代谢，并有助于花形态的分化.本研究中，tzR在侧端和顶端成花路径的未分化期→分化初期阶段分别升高350%和63%，对三角梅的花芽分化具有明显的促进作用，与孙红梅等[24]在金花茶(Camellianitidissima)花及姜成英等[25]在油橄榄(Oleaeuropaea)中的研究结果相符.IAA是调控植物成花的常见激素之一，低浓度时可以促进花芽分化，而高浓度时则起抑制作用[26].本研究发现，在三角梅的成花过程中IAA浓度一直维持在较低水平，而在未分化的小叶中IAA浓度则维持在较高水平，与前人的研究结果相符.

相同激素在不同的植物中也可能发挥完全相反的作用.例如，高水平ABA能促进侧柏(Platycladusorientalis)成花[27]，而对枇杷(Eriobotryajaponica)植株喷洒ABA却可以有效地抑制其成花[28].在三角梅中，本研究发现ABA在侧端成花的未分化期→分化初期(刺→花刺)阶段水平提升了230%，说明ABA可能促进三角梅侧端成花，这与前期研究发现高水平ABA能促进苹果成花[29]的结论一致；然而，ABA在顶端成花早期(叶芽→花芽)阶段保持较低水平且变化较小(8%)；暗示ABA在三角梅顶端成花中可能不起作用或有一定的抑制作用.

3.2 三角梅顶端和侧端成花的激素相互作用差异

植物成花是一个复杂的过程，在不同阶段受不同激素的调控，植物内源激素之间也存在着相互作用.例如，外源GA3处理苹果会增加IAA水平，降低tzR、ABA水平，从而抑制花芽分化[21].在三角梅的成花过程中，本研究发现激素之间也存在相互作用，例如在成花早期，GA7和GA4水平变化保持着较好的相关性.虽然GA4在未分化期→分化初期阶段的侧端和顶端成花路径呈现上升和下降的不一致，但是在高等植物的GA代谢通路中，GA4和GA7均由GA9形成[30]，因此可推测GA4在顶端和侧端水平的变化差异或许是由GA4和GA7合成速度差异及其他调控因素(如光照)差异所致，需要进一步的分子实验证明.有趣的是，除DHZ外，所有水平变化较大的激素(GA4、GA7、cis-OPDA、ABA、tZ、tzR、CS和ACC)都在三角梅成花早期有大幅度的水平提升且相互促进，这说明三角梅的侧端可能通过提高这些激素的水平来促进成花.在顶端成花过程中，CS与GA4、SA的水平存在高度负相关，GA4与SA之间则存在高度正相关.跟踪激素水平变化发现，GA4和SA在三角梅成花的未分化期→分化初期阶段均有明显下降趋势，CS的水平则有明显升高.因此，GA4和SA可能对顶端成花过程中的花芽分化起抑制作用，并与CS相互拮抗.

对三角梅成花早期过程中的激素变化情况及可能调控作出总结：GA7、cis-OPDA、tZ和CS在三角梅的花芽早期分化过程中的水平均有明显升高或具有较高水平，因此在诱导三角梅花芽分化时提高这些激素的水平，极大可能有效促进三角梅成花；而在诱导三角梅花芽分化时提高ABA、tzR和ACC的水平，可能单独促进三角梅侧端成花；在诱导三角梅花芽分化时提高DHZ水平，同时降低SA、GA4的水平，则可能单独促进三角梅的顶端成花(图4).此外，在三角梅成花过程中，IAA一直处于较低水平，而作为对照的小叶中IAA水平则持续处于相对较高水平，因此通过降低IAA的水平也可能促进三角梅成花.GA7、cis-OPDA、GA4和tZ可能作为节点激素在三角梅成花早期扮演着关键调控角色.这些工作将为深入理解三角梅成花的分子机制提供参考，也可为在生产实践中实现三角梅的精准花期调控提供数据支持.当然，本研究的样本采集主要依据三角梅成花早期的组织形态变化，与模式植物拟南芥的成花生理发育分期不一致，因此结论难以直接比较，不同激素之间的相互作用机制也仍需进一步研究.

图中激素的水平变化均超过50%.