达氏鳇血细胞的组成、发生及吞噬功能研究

刘霞飞，杨合霖，丰超杰，吕伟华，张颖

（1.大连海洋大学，辽宁 大连 116023；2.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070）

达氏鳇（Huso dauricus）隶属于鲟科（Acipenseridae）、鳇属（Huso），是世界现存2 种鳇属最大型淡水鱼类之一，最大个体可达1 000 kg 以上[1]。达氏鳇为黑龙江特有珍稀名贵鱼类，经济价值较高，其卵制成的鱼子酱被称为“黑黄金”，与松露、鹅肝并称为世界三大美食。20 世纪80 年代后，受过度捕捞、环境污染及水利工程等因素的影响，达氏鳇的野生资源量急剧下降，濒危状况十分严重[1]。目前，达氏鳇已为国家Ⅰ级保护物种。达氏鳇性成熟迟、群体年龄复杂、幼鱼成活率低、补充群体小等，资源一旦遭到破坏，很难恢复，恢复期长达几十年。因此，有关达氏鳇保护生物学的相关研究对其物种保护十分重要[1]。

血细胞是机体免疫的重要组成成分，不仅参与吞噬、分泌等功能，还参与机体的伤口修复、防御等生理机制，对自身生理状态变化和对外界环境因子刺激非常敏感,在维持机体生理稳态方面具有重要作用[1]。鱼类血细胞的形态、数量、结构和功能具有种属差异性和环境差异性其。目前，已研究了中华鲟（Acipenser sinensis）[1，4]、高首鲟（A.transmontanus）[1，6]、杂交鲟（Huso dauricus ♀×Acipenser schrenckii ♂）[1，7]和施氏鲟（A.schrenckii）[1，8]等鱼类血细胞组成、发生及功能等，但有关于达氏鳇血细胞的研究仅有外周血细胞的形态学[1，9]。本研究观察和分析了达氏鳇血细胞的组成、发生和吞噬功能，为达氏鳇血细胞的研究提供更多的基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用达氏鳇1 龄鱼，平均体长为（359±37.269）mm，平均体质量为（324.24±214.7）g，来自中国水产科学院黑龙江水产研究所呼兰试验站，暂养在水温（14.3±2.2）℃，溶解氧≥6 mg/L，循环水和增氧条件下，取健康个体进行实验。

1.2 方法

1.2.1 显微结构观察

取健康个体，用1 mL 一次性无菌注射器从尾椎静脉取血，血液与肝素钠（1%）混合，涂片，空气中干燥后，用2.5%戊二醛固定，Wright's 染色，中性树胶封片。Leica 显微镜油镜观察、拍照，并选取5 张涂片测定血细胞大小，每种测定50 个细胞，结果用平均值±标准差（x±SD）表示。

1.2.2 酵母吞噬实验

1.2.2.1 制备酵母液

将1 g 高活性酵母用蒸馏水定容至15 mL 作为酵母液，然后高压锅120℃灭菌30 min，待稍冷却后，置于25～30℃培养箱中，1～2 d 后3 000 r/min，4℃离心2 min，去上清，灭菌生理盐水悬浮，4℃冰箱保存备用。使用前稀释[1，10]。

1.2.2.2 制备血液

尾椎静脉取血后快速加入肝素钠抗凝，用0.1 mol/L PBS 稀释[1，10]。

1.2.2.3 血细胞酵母吞噬实验

将上述调整浓度后的血液和酵母液加入灭菌后的离心管中，充分混合30 s，30℃恒温水浴锅40 min。孵育完成后涂片，待干燥后用2.5%戊二醛固定6 min，Wright's 染色、封片。随机取3 尾鱼进行血细胞吞噬实验，每尾鱼制作2 张涂片，每张统计50 个细胞中吞噬酵母菌的个数，计算吞噬率[（吞噬酵母的红细胞数÷计数总红细胞数）×100%]。接触酵母自身变形甚至伸出伪足或胞浆内含有酵母的为吞噬的红细胞。

1.2.3 达氏鳇血细胞的发生

擦净鱼体表面，间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（MS-222）麻醉鱼体后解剖，取出鱼的头肾、体肾、脾脏和肝脏，用生理盐水清洗表面的血渍，用吸水纸吸干，用刀片将每个器官横切，将切面轻轻与玻片接触，迅速制取切片。每尾鱼各器官各制作印迹片10 张，待干后用Wright's 染液染1～2 min，加入磷酸缓冲液浸泡3～5 min，用蒸馏水浸泡冲洗5～7 min，晾干。中性树胶封片。

每张印片随机取5 个视野，对各个细胞系按照不同的发育阶段进行描述，分类计数[11]。用Leica 显微镜油镜观察并拍照，随机选择各10 个细胞测量长径和短径。

1.3 数据处理

实验数据用平均值±标准差（x±SD）表示，用Excel 2016 软件处理，照片用Adobe Photoshop19.0处理，同比例缩放图像和标尺。

2 结果与分析

2.1 各类细胞的组成及发育过程

达氏鳇外周血细胞可以分为红细胞和白细胞，其中白细胞包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和血栓细胞，未观察到嗜碱性粒细胞（图1）。头肾、体肾、脾脏、肝脏组织印片中各类血细胞大小测量结果如表1 所示，血细胞分类及发育阶段参照Fijan[12]所推荐的标准。

表1 达氏鳇血细胞的大小和白细胞分类计数值（x±SD）Tab.1 Size of different blood cells and counts of differential leucocytes（DLC）of huso sturgeon H.dauricus

2.1.1 红细胞

血涂片中主要以红细胞为主。达氏鳇红细胞呈卵圆形，表面光滑无突起。核呈圆形或椭圆形，着色深，位于细胞的一侧或偏向细胞一侧。胞质着色浅。外周血细胞中，可以观察到早期成熟红细胞（图1-c），细胞和核呈圆形，位于细胞中央（图1-a）。

印片结果显示，达氏鳇原红细胞，呈圆形或椭圆形，细胞体较大且胞质少。细胞核相对较大，占据细胞的大部分，位于胞质中央或一侧，核膜明显（图2-o）。其幼红细胞，可以分为早、中、晚幼红细胞三个发育时期。三个发育期的胞体均小于原红细胞。三种红细胞均呈圆形或椭圆形，表面均光滑，少有突起，细胞核呈圆形或椭圆形，位于细胞中央或偏向一侧。

2.1.2 粒细胞

达氏鳇嗜中性粒细胞呈圆形或椭圆形，胞质着色浅。细胞核呈多叶形，肾形或马蹄形，常偏于细胞一侧或与细胞膜相切着色深（图1-c）。嗜酸性粒细胞呈圆形，在血涂片中数量极少，其细胞表面有较大且着色深的圆形颗粒，细胞核呈肾形或多叶形（图1-c），常位于细胞一侧（图1-b）。

印片结果中的原粒细胞呈圆形或卵圆形，表面光滑，胞质蓝色。细胞核占据细胞的2/3～4/5，呈圆形或卵圆形，有一侧与膜相切或靠近（图2-p）。早幼粒细胞呈圆形或卵圆形，细胞质有嗜天青颗粒出现。细胞核呈椭圆形，偏于细胞一侧，约占细胞的1/2，早幼粒细胞核内染色质较深（图2-t）。

从中幼粒细胞开始，细胞内的嗜天青颗粒的数量逐渐减少，有较多的特殊性颗粒，可以根据特殊性颗粒明显区分两种不同的粒细胞。嗜中性中幼粒细胞细胞呈圆形或椭圆形，细胞核偏于细胞一侧，核内染色质聚集明显（图2-q）。嗜酸性中幼粒细胞呈圆形或椭圆形，体积比嗜中性中幼粒细胞小，细胞核偏于细胞一侧（图2-w）。

晚幼粒细胞呈圆形或椭圆形，根据特殊性颗粒颜色可以分为嗜中性晚幼粒细胞和嗜酸性晚幼粒细胞。嗜中性晚幼粒细胞比中幼粒细胞体积要小，呈圆形或椭圆形，细胞核内染色质浓缩集聚，充满无色颗粒，形状多样，为不规则的圆形，杆状，偏于细胞一侧（图2-w）。嗜酸性晚幼粒细胞比中幼粒细胞体积要小，呈圆形，其细胞核形态多样，有圆形，肾形或分叶形，常偏于细胞一侧。胞质集聚染色质呈块状，嗜酸性颗粒增多（图2-v）。

成熟粒细胞呈圆形或椭圆形，细胞形态与晚幼粒细胞形态相似，但是体积比晚幼粒细胞要小，嗜中性和嗜酸性成熟粒细胞细胞核均偏于细胞一侧，与细胞膜相切，染色质有大量的特异性颗粒。

2.1.3 单核细胞

外周血细胞中单核细胞呈圆形，有的会有多个伪足突起，是白细胞中最大的细胞。细胞核呈圆形或肾形，占据整个细胞的1/2 左右，位于细胞中央或一侧（图1-b）。

根据印片中结果可见，原单核细胞体积大，是所有原血细胞中体积最大的，呈圆形，细胞核呈不规则形，偏于细胞一侧（图2-r）。幼单核细胞呈圆形或不规则形，体积比原单核细胞小，有伪足状的突起，有的胞浆内有少量细小的嗜天青颗粒出现（图2-s）。

2.1.4 淋巴细胞

大淋巴细胞呈圆形或椭圆形，表面有许多类似绒毛一样的突起，细胞核较大，基本上占满整个胞质（图1-b）。小淋巴细胞呈圆形、椭圆形或不规则形，有明显的向外伸出的伪足状的表面突起，细胞核占据胞质的2/3 左右（图1-c）。

原淋巴细胞呈圆形或椭圆形，偶见伪足突起，是最小的原血细胞。胞质嗜碱性呈蓝色且少。细胞核呈圆形或椭圆形，占细胞体积的大部分（图2-r）。幼淋巴细胞呈圆形或椭圆形，胞质较原淋巴细胞有所增多，偶见伪足，有嗜天青颗粒，细胞核呈圆形或椭圆形（图2-r）。根据淋巴细胞的大小可以分为大淋巴细胞和小淋巴细胞。两者经常可以观察到有胞突，细胞质少，有些只能观察到轮廓甚至几乎没有。

图2 达氏鳇血细胞发生Fig.2 Hematopoiesis in different developmental stages in huso sturgeon H.dauricu

2.1.5 血栓细胞

血栓细胞呈圆形或椭圆形，表面光滑。细胞核呈椭圆形或杆状或肾形，位于细胞中央。细胞质极少，部分细胞呈裸核状。常见2 个及2 个以上的细胞聚集在一起（图1-a）。

图1 达氏鳇外周血细胞Fig.1 Peripheral blood cells of huso sturgeon H.dauricus

2.2 三种组织中各种血细胞的比例

头肾、体肾、肝脏和脾脏4 种组织中，各种血细胞原始，幼稚和成熟阶段数量占总数的比例见表2。其中，原红细胞在头肾中比例最大，为1.63%，其次是体肾、脾脏，为0.89%和0.56%，肝脏中未见；原始粒细胞在体肾和头肾中比例大，分别为1.47%和2.45%，在脾脏和肝脏中也存在，但是比例比较低；原淋巴细胞在脾脏中所占比例要比其他器官高，为1.57%，其次是头肾和体肾；原单核细胞在头肾中所占比例最大，为1.33%，其次是体肾，为1.21%。成熟红细胞在肝脏中所占比例最大，为88.71%；成熟粒细胞在头肾和体肾中所占比例较大，在肝脏和脾脏中所占比例较少。因此达氏鳇的红细胞、粒细胞、单核细胞主要发生在头肾和体肾，淋巴细胞主要发生在脾脏。

表2 4 种组织中不同血细胞的百分比/%Tab.2 Percentage of different blood cells in 4 kinds of tissues

2.3 血细胞吞噬酵母的观察

吞噬实验表明，达氏鳇血细胞中红细胞具有吞噬能力，且粒细胞和单核细胞都有吞噬、黏附酵母的现象。实验能观察到血细胞吞噬酵母的多种现象：①红细胞靠近酵母细胞，伸出伪足牵引酵母细胞（图3-f）；②吞噬完1 个酵母细胞的红细胞仍然可以黏附酵母细胞（图3-h）；③黏附酵母的红细胞的细胞膜明显凹陷（图3-h）；④红细胞可黏附两个及多个酵母细胞（图3-i）；⑤也存在两个红细胞黏附同一个酵母细胞（图3-j）。红细胞的吞噬率为（22.84±3.21）%。

图3 达氏鳇血细胞吞噬酵母现象Fig.3 Phagocytotic yeasts of blood cells in huso sturgeon H.dauricus

3 讨论

3.1 达氏鳇外周血细胞的组成特征

与齐口裂腹鱼[13]、成年似鲇高原鳅[14]等鱼类的血细胞组成一样，达氏鳇的外周血细胞由红细胞，粒细胞，血栓细胞，单核细胞和淋巴细胞等组成。红细胞承担着鱼体内运输氧气和吞噬的功能。周永灿等[15]认为，鱼类红血细胞的大小因种类和生活环境而有一定差异；林浩然[16]认为，红细胞大小与运动能力强弱有关；邓时铭等[17]也认为红细胞的数量和大小影响鱼类的运动水平。达氏鳇外周血细胞中红细胞的体积要比鲤科鱼类[18]小，数量也要少，因此，达氏鳇的运动能力要比鲤科鱼类弱。

在众多鱼类外周血细胞研究中，甚至是同一种鱼血细胞分类组成差异也极大。姚德冬等[4]认为，中华鲟白细胞中血栓细胞数量最多，然而，张艳珍等[5]却认为白细胞中淋巴细胞数量最多。在达氏鳇白细胞中，观察到以淋巴细胞数量居多，这也与点带石斑鱼（Epinephelus coioides）[19]、鳜（Siniperca chuatsi）[20]、欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）[21]、杂交石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂）[22]和卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）[23]等相同，而美国红鱼（Sciaenops ocellatus）[24]、淡水石斑（Cichlasoma managuense）[25]、军曹鱼（Rachycentron canadum）[26]和小点猫鲨（Scyliorhinus canicula）[27]等外周血细胞中以血栓细胞数量居多。鱼类血栓细胞的数量次于淋巴细胞的白细胞[28]。达氏鳇外周血细胞以淋巴细胞数量居多，占白细胞总数的50%以上，原因可能是达氏鳇是大型溯河洄游鱼类，习惯长距离洄游向产卵场，且喜欢栖息在水体中下层，在这过程中容易受伤，白细胞中的淋巴细胞能够在达氏鳇受伤后快速凝血，并将入侵的病原杀死，形成免疫保护。

与中华鲟[4]、高首鲟[6]、杂交鲟[7]和施氏鲟[8]情况一致，达氏鳇的粒细胞有嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，未发现有嗜碱性粒细胞。这可能与制片过程中容易解体有关[29]，也可能是因为嗜碱性粒细胞数量太少，观察范围受限，不能全面的进行观察。而林光华等[29]认为，草鱼（Ctenopharyngodon idellus）的嗜碱性粒细胞只在幼龄鱼中出现,在成鱼中未观察到。可见，嗜碱性粒细胞易水解可能是观察不到的一个原因,也可能随着鱼类的生长而消失，因此，达氏鳇外周血细胞中是否有嗜碱性粒细胞尚未定论。

3.2 鱼类血细胞的吞噬功能

目前，有关生物个体红细胞免疫功能的研究很多很深入，其相关研究主要集中在猪等哺乳动物上，而有关于鱼类红细胞免疫功能的研究报道则较少。本研究发现，达氏鳇血细胞中红细胞有明显的吞噬酵母的现象，吞噬率达到了（22.84±3.21）%。血细胞的吞噬能力是鱼类的一种重要免疫保护机制；在外周血细胞中红细胞的数量远远高于其他血细胞，因此红细胞在面对入侵的免疫复合物时会形成病原识别体以此保护自身的安全。粒细胞是鱼体免疫细胞，能参与机体炎症反应杀灭病原菌，也可吞噬或吞饮细菌及寄生虫幼虫，起到免疫防御的功效[30]。本实验中发现粒细胞和单核细胞也能黏附酵母也验证了这一结论。

3.3 鱼类血细胞的发生场所

Zapata 等的研究证实，硬骨鱼类的头肾通常被认为是类似于哺乳动物的骨髓，具有造血功能，体肾是造血干细胞归巢和分化的场所[31]，脾的造血功能通常仅限于红细胞和血栓细胞的生成[33]。与美国红鱼[24]、长吻鮠（Leiocassis longirostris）[31]、日本黄姑鱼（Argyrosomus japonicus）[35]和斑马鱼（Brachydanio rerio var）[36]研究结果一致，且根据各组织中未成熟的细胞占细胞总数的比例（表2）为依据，达氏鳇红细胞，粒细胞和单核细胞的发生场所主要是头肾和体肾，淋巴细胞的发生场所主要是脾脏。对于肝脏的造血功能结论也不同，原始血细胞并未在肝脏中发现，反而是成熟血细胞在肝脏中的比例比较高，因此认为肝脏可能不是造血器官。但是，是否把肝脏作为造血器官还需要更多的探究。