基于GEO数据库研究结肠癌的生物标志物

文雪梅　　夏俊凯　　张丽静　　贾彦彦　　张文俊

[摘要] 目的 通過生物信息学筛选出结肠癌中的关键基因，为结肠癌分子生物研究及早期诊断相关生物标志物筛选提供理论依据。方法 从GEO数据库中选择编号为GSE10950、GSE74602和GSE110224的基因芯片，利用R语言下载评估芯片质量，对样本进行规范化处理并筛选出差异基因（DEG），通过TCGA下载结肠癌的表达数据，验证DEG的准确性，通过DAVID在线网站对DEG进行GO分析和KEGG富集分析，通过STRING在线网站得到DEG的蛋白互作网络，利用Cytoscape 软件筛选出枢纽基因（hub基因），Oncomine数据库从基因层面验证hub基因的表达，cBioPortal数据库分析hub基因在结肠癌中的突变情况，最后通过UALCAN及TCGA数据库评估hub基因在结肠癌诊断方面的价值。结果 通过 GEO数据库共筛选出结肠癌132个DEG，经TCGA数据库验证后最终得到131个DEG，其中表达下调DEG 78个，表达上调DEG 53个，通过STRING、Cytoscape筛选出10个hub基因，选取排名靠前的DTL等4个hub基因进一步分析，最终证明了DTL、CCNA2、BUB1、KIF23基因在结肠癌中的高表达并可能作为早期诊断结肠癌的标志物。结论 通过生物信息学分析研究筛选出结肠癌的关键基因，并证明蛋白编码基因DTL、CCNA2、BUB1、KIF23有可能作为早期诊断结肠癌的生物标志物。

[关键词] 结肠癌;生物信息学;GEO数据库;TCGA数据库;生物标志物

[中图分类号] R735.3          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2022）09-0001-07

Research on biomarkers of colon cancer based on GEO database

WEN Xuemei1   XIA Junkai1   ZHANG Lijing2   JIA Yanyan1   ZHANG Wenjun3

1.Xinhua Clinical College， Dalian University，Dalian   116021， China;2.Department of Gastroenterology， Xinhua Hospital Affiliated to Dalian University， Dalian   116021， China;3.Department of Anorectal Surgery， Xinhua Hospital Affiliated to Dalian University， Dalian   116021， China

[Abstract] Objective To screen out key genes in colon cancer through bioinformatics， and provide a theoretical basis for the molecular biology research of colon cancer and the screening of relevant markers for early diagnosis. Methods The gene chips numbered GSE10950， GSE74602， and GSE110224 were selected from GEO database. R language was used to download and evaluate the quality of the chip. The sample was standardized and the differential gene （DEG） was screened out. The expression data of colon cancer was downloaded through TCGA to verify the accuracy of DEG.GO analysis and KEGG enrichment analysis of DEG was performed through DAVID online website. The DEG′s protein interaction network was obtained through the STRING online website. The hub gene was screened out using the Cytoscape software. The expression of hub genes verified by Oncomine database. The mutation of hub gene in colon cancer was analyzed through cBioPortal database. And finally the value of hub gene in colon cancer diagnosis was evaluated through UALCAN and TCGA databases. Results A total of 132 DEGs for colon cancer were screened through the GEO database. After verification by the TCGA database， 131 DEGs were finally obtained. Ten hub genes were screened through STRING and Cytoscape. The top 4 hub genes， including DTL， were selected for further analysis. It was proved that DTL， CCNA2， BUB1， KIF23 genes were highly expressed in colon cancer and might be used as markers for early diagnosis of colon cancer. Conclusion This study screened out the key genes of colon cancer through bioinformatics analysis， and proved that the protein coding genes DTL， CCNA2， BUB1， KIF23 might be used as biomarkers for the early diagnosis of colon cancer.

[Key words] Colon cancer; Bioinformatics; GEO database; TCGA database; Biomarkers

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，其发病率、死亡率分别居全球恶性肿瘤的第4位和第2位[1]，且仍处于上升阶段[2]。结肠癌高死亡率的主要原因是缺乏早期症状，且临床常用的肿瘤标志物缺乏诊断早期结直肠癌的能力，某些分子的表达水平又因人而异，在此情况下，早期筛查和诊断的难度明显增加。因此，找到新的能有效诊断早期结直肠癌的标志物也就十分重要。

近年来，高通量测序技术及基因芯片研究受到医药领域的广泛关注，一些数据库含有大量样本的特征为医学研究的可靠性及可行性提供了一定的保证。通过对这些大数据的研究分析，可以从上万个基因中筛选出在肿瘤发生发展中有重要作用的关键基因。本文通过生物信息学发现并研究一些关键基因在结肠癌中的表达情况，并进一步分析关键基因诊断早期结肠癌的潜力，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

从公共基因芯片（gene expression omnibus，GEO）数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.g——ov/geo）选取表达谱芯片数据集GSE10950、GSE74602及GSE110224，芯片信息见表1。从癌症和肿瘤基因图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov/）选取结肠癌转录组数据，共包含41例正常样本和480例肿瘤样本。分析工具主要为R语言（R×64 4.02版本）及各类R包、Cytoscape（3.8.0版本）、Graphad Prism 7统计软件、MedCalc  Application统计软件（19.1.0版本）以及各类在线數据分析网站。

1.2 方法

1.2.1 筛选差异基因  通过GEOquery R包[3]对选取的GEO芯片数据进行下载、预处理及规范化。对处理后的数据进行分析，设置筛选条件为校验P值小于0.05（adj.P.value<0.05），表达变化倍数的绝对值大于2（|log2FC|>1），并利用limma R包[4]分别筛选出3个芯片数据集的表达差异基因（differentially expressed genes，DEG）。通过在线软件draw Venn diagrams（http：//bioinformatics.psb.uge--nt.be/webtools/Venn/）获得3个数据集取交集后的重叠DEG。

1.2.2 验证差异基因  通过TCGAbiolinks  R包[5]下载TCGA数据库中结肠癌的转录组数据，按照疾病部位为Colon，项目为 TCGA-COAD，数据种类为transcri ptome profiling，实验种类为RNA-seq，工作流程的类型为HTSeq-counts进行数据下载。通过NCBI获得人类基因组注释文件GTF进行数据合并及注释转换。设置DEG筛选条件为：|log2FC|>1，adj.P<0.05，利用DESeq2 R包[6]分析整理并得到DEG，并通过draw Venn diagrams与GEO得到的重叠DEG合并，以验证GEO数据库得到的DEG。根据LogFC的大小使用pheatmap R包[7]绘制最终所得DEG的聚类热图。

1.2.3 差异表达基因的功能富集分析  用于注释可视化和集成发现的数据库（database for annotation， visualization and integrated discovery，DAVID）（版本6.8）是一种在线数据库（ https： //David.ncifcrf.gov/），该数据库集成了大量生物数据和相关分析工具，提供了系统而全面的生物信息高通量基因表达的功能注释信息[8]。 将最终所得DEG导入DAVID数据库中，进行DEG的基因本体论（gene ontology，GO） 注释、京都基因和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）途径分析，研究DEG在细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular func-tion，MF）、生物学过程（biological process，BP）及参与信号途径方面的富集情况。设定 P<0.05 为差异有统计学意义。

1.2.4 筛选枢纽基因相互作用基因（或蛋白质）检索工具STRING数据库（search tool for the retrieval of interacting genes，STRING）是一种在线工具（http：//string-db.org/），旨在评估和整合蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）信息，如物理和功能关联，迄今为止，STRING 11.0版涵盖了来自2，031个生物体的9，643，763个蛋白质[9]。通过STRING数据库获得DEG蛋白质互作（protein-protein interaction ，PPI）网络，再将 PPI 网络导入 Cyto-scape 软件进行可视化分析，并利用插件 cytoHubba 筛选出枢纽基因（hub） 基因。

1.2.5 验证hub基因  Oncomine数据库（http：//www.oncomine.org）是一种癌症微阵列数据库和基于Web的数据挖掘平台，旨在激发全基因组表达分析的新发现，并比较大多数主要类型癌症与各自正常组织中的转录组数据[10]。通过Oncomine数据库分析hub基因在常见肿瘤中的表达情况。并选择相应数据集，下载hub基因在结肠癌与正常结肠组织中的表达数据，利用Graphad Prism 统计软件分析并绘制表达箱线图，验证hub基因在结肠癌中的表达情况。

1.2.6 分析hub基因的基因突变率  cBioPortal数据库（https：//www.cbioportal.org/）主要用于探索多维度癌症基因组数据，以可视化分析基因、样本和数据库类型。使研究者可以交互探索不同样本、基因、通路在遗传学上的改变，并与临床数据相结合[11]。通过cBioPortal数据库选取合适的结肠癌数据集，分析hub基因在结肠癌中的突变率，研究在结肠癌中hub基因的表达变化是否因基因本身发生突变所致，以此推测hub基因在结肠癌中的表达稳定性。

1.2.7 评估hub 基因对结肠癌的诊断价值  UALCAN数据库（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）是一个交互式Web资源，使研究人员能够快速轻松地分析来自TCGA数据库的数据[12]。利用UALCAN数据库获得hub基因在结肠癌不同分期的表达情况，确认hub基因是否在早期结肠癌中出现表达升高的情况，然后整理TCGA获得的基因表达数据，并利用统计软件MedCalc  Application（19.1.0版本）得到hub基因的受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）及曲线下面积（area under curve，AUC），评估hub用于诊断结肠癌的潜力。

1.3 统计学分析

本研究差异基因的统计学分析通过R软件进行，并采用非参数检验中的Mann-Whitney检验进行统计分析。hub基因验证的统计学分析通过Graphad Prism 统计软件，并采用非配对t检验进行分析。ROC曲线绘制及AUC计算通过MedCalc Application进行。所有分析均采用双尾检验，α=0.05 为检验水准，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DEG的筛选及验证

通过R语言对选取的3个GEO芯片数据集的各表达谱进行分析，对数据集的各样本表达谱进行规范化处理，按筛选条件通过limma R包筛选出各芯片数据集的DEG，并取交集后，共得到132个重叠DEG（封三图1A），其中表达上调DEG 53个，表达下调DEG 79个。通过对自TCGA下载的结肠癌数据进行分析，共得到上调DEG 2863个，下调DEG 2552个。与GEO所得重叠DEG取交集后，排除GEO数据库筛选得到的下调基因腺苷A3受体（adenosine A3 receptor，ADORA3），其余131个DEG均符合差异表达基因标准（封三图1B），并通过pheatmap R包绘制最终所得DEG在各个数据集中的聚类热图（封三图1C）。

2.2 DEG的GO分析和KEGG 途径分析

通过DAVID 进行DEG的GO 分析（封三图2）和 KEGG 途径富集分析（表2）。GO分析结果显示，DEG主要富集在细胞外泌体（extracellular exosome）、细胞表面（cell surface）及顶端质膜（apical plasma membrane）等细胞外部区域（封三图2CC）;主要参与细胞增殖（cell proliferation）、细胞外基质的组织（extracellular matrix organization）、氯离子跨膜转运（chloride transmembrane transport）以及基因表达的正向调控（positive regulation of gene expression）等生物学过程（封三图2 BP）;主要参与转运活性（transporter activity）、蛋白激酶结合（protein kinase binding）、生长因子活性（growth factor activity）、结构分子活性（structural molecule activity）、钙离子结合（calcium ion binding）等分子功能（封三图2 MF）。KEGG 途徑分析显示，补体及凝血级联（complement and coagulation cascades）、氮代谢（nitrogen meta-bolism）、白细胞跨内膜迁移（leukocyte transendothelial migration）、细胞周期（cell cycle）、NF-κB信号通路（NF-kappa B signaling pathway）等是DEG的主要富集信号途径（表2）。

2.3 差异表达基因蛋白质互建网络分析

将最终得到的131个重叠DEG输入STRING在线网站后得到PPI网络（图1A），将所得PPI信息下载后导入Cytoscape软件中，利用 cytoHubba 插件筛选 hub基因并进行可视化，分别按MCC、Degree等12种计算方法进行分析，得到驱动蛋白家族成员23（kinesin family member 23，KIF23）等10个hub基因，为了便于后续深入分析，选取KIF23、有丝分裂检查点丝氨酸/苏氨酸激酶（BUB1 mitotic checkpoint serine/threonine kinase，BUB1）、细胞周期蛋白A2（cyclin A2，CCNA2）、无齿E3泛素蛋白连接酶同源基因（denticleless E 3 ubiquitin protein ligase homolog，DTL） 4个排名靠前的蛋白编码基因进一步分析（图3B）。

2.4 验证hub基因在结肠癌中的表达

基于Oncomine数据库分析4个hub基因在多肿瘤中的表达趋势，结果显示4个hub基因在肿瘤中多呈高表达状态（图2A）。进一步选择Ki Colon[5]、Sabates-Bellver Colon[6]两个结肠癌数据集进行分析，结果显示相对于正常结肠组织，4个hub基因在结肠癌中明显高表达（图3）。

2.5分析hub基因的基因突变率

通过cBioPortal数据库选取Kishore Guda等[13]、 Suhas Vasaikar等[14]的2项结肠癌数据集（CaseCCC、 PNAS 2015、CPTAC-2 Prospective、Cell 2019），共包括来自139例结肠癌患者的139份样本。分析发现，BUB1等4种基因在结肠癌中的基因突变率均较低，最高的为BUB1，但也仅为4.0%（图4），说明DTL等4种基因在结直肠癌中通过自身突变致癌的可能性低，其高表达可能是受到上游基因调控的结果，间接证明DTL等基因在结肠癌中的表达具有较好的稳定性。

2.6 hub 基因对结肠癌的诊断价值评估

通过UALCAN数据库得到来自TCGA数据库的315例临床资料，分析 hub基因在结肠癌不同分期中的表达情况，结果显示4个hub基因在结肠癌早期即出现了明显的表达升高情况，并有随着疾病进展表达逐渐降低的趋势（图 5）。通过MedCalc得到4个基因的ROC及AUC，结果显示4个hub基因的AUC均大于0.9（图2B），说明DTL等4种基因具有潜力可能作为结肠癌的诊断标志物。

3 讨论

本文从GEO数据库选取了3个结肠癌的芯片数据集，通过取交集的形式初步筛选出了132个在结肠癌中的差异表达基因，并进一步通过TCGA的结肠癌数据验证了所得DEG的准确性，最终得到131个DEG，其中上调的DEG 53个，下调的DEG 79个。GO分析显示这些DEG主要参与相关分子功能和生物学过程，KEGG分析提示DEG主要在细胞周期、NF-κB信号通路等信号途径富集，而这些生物功能或通路均与肿瘤的发生发展有密切联系。为了进一步找到hub基因，将得到的131个DEG导入到STRING在线网站并得到PPI网络，将该PPI网络导入到Cytoscape中，通过cytoHubba 插件的12种计算方法筛选后，得到hub基因。本文选取其中排名靠前的DTL等4个hub基因进一步分析。通过Oncomine数据库发现，DTL等4个hub基因在多种肿瘤中明显高表达且较稳定，亦验证了其在结肠癌中的高表达。为了研究4个hub基因诊断早期结肠癌的潜力，首先通过UALCAN在线数据库分析来自TCGA数据库的315例样本发现，DTL、KIF23、BUB1、CCNA2基因均在结肠癌的早期出现明显高表达。此外，通过cBioPortal数据库证实DTL等4种基因在结肠癌中的基因突变率偏低，说明DTL等4种基因表达具有较高的稳定性，符合诊断生物标志物的特点。最后，通过计算ROC曲线及AUC发现，这4个hub基因的AUC均大于0.9，证明它们的诊断早期结肠癌的准确率较高。

DTL又称CDT2、DCAF2 或 RAMP，其在细胞周期、DNA复制及基因组稳定过程中发挥重要作用[16]。有研究发现，DTL在多种肿瘤中高表达，并被视为一种促癌基因[17]。Chen等[18]在实验中发现，抑制DTL的表达能进一步抑制微管相关蛋白TPX2的表达，并认为DTL是通过癌细胞衰老诱导治疗肝癌的潜在新靶基因。但在结肠癌中，尚无研究说明DTL的具体作用机制。CCNA2是一种高度保守的细胞周期蛋白，在控制細胞周期中起关键作用，CCNA2常在肿瘤中发挥促癌作用[19]。据Hung等[20]研究报道，在乳腺癌中，CCNA2缺失会导致蛋白激酶ERK活性受损和乳腺肿瘤细胞转移减弱，在肝细胞癌中，CCNA2的表达通过激活PI3K/AKT促进肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移[21]，CCNA2还能通过整联蛋白αVβ3信号传导途径促进非小细胞肺癌的侵袭和迁移[22]。Gan等[23]在实验中发现，在结肠癌中，CCNA2在癌组织中的表达高于正常组织，并且CCNA2敲低可以通过削弱细胞周期进程并诱导细胞凋亡显著抑制结肠癌细胞的生长。

BUB1被认为是一种癌基因。据Piao等[24]发现，BUB1在胰腺癌组织中显著过表达，且表达与胰腺癌的肿瘤大小相关。在胶质母细胞瘤中，通过抑制BUB1的表达出现癌细胞增殖减弱及肿瘤生长延迟现象[25]。生物信息学研究显示，BUB1在乳腺癌及肝癌等肿瘤中高表达并具有可能作为靶向治疗的标志物[26-27]，在乳头状肾细胞癌中也得到同样的结论[28]。有研究表明，BUB1的种系突变会增加结直肠癌的患病风险，但这种突变在结肠癌中并不常见，且这种说法还未得到充分证明[29-30]。KIF23已被证明可在体外驱动微管运动，并能与丝氨酸/苏氨酸激酶家族（Aurora家族）的蛋白激酶相互作用，在有丝分裂步骤中起关键作用[31]。在乳腺癌中，KIF23水平升高与癌相关核调节蛋白ANCCA在肿瘤中的水平相关，且与ER阳性乳腺癌患者的无复发生存率低相关[32]。还有研究显示，KIF23在肺癌中表达升高，是潜在的分子标记[33]，同BUB1一样，有研究报道KIF23在肿瘤中的水平升高可能是由于染色体的额外复制导致[34]。在结肠癌中，KIF23可能受到长链非编码RNA UCA1的调控而发挥促癌作用[35]。目前针对DTL等基因表达升高的机制尚存在争议，有研究者认为这是由于自身基因突变导致[29-30，34]。

总之，本文将生物信息学方法、高通量测序技术及基因芯片和大数据分析结合起来，发现并验证了DTL、KIF23、BUB1、CCNA24个基因不仅在结肠癌早期出现中高表达且较稳定，同时基因突变率偏低，符合诊断生物标志物的特点并证明在早期结肠癌诊断中的准确率较高，因此有可能作为早期诊断结肠癌的生物标志物。且这4个基因在结肠癌中的高水平表达更多的是受到上游基因的调控导致，要进一步研究DTL等基因在结肠癌中的作用及作用机制，需重点关注其上游的调控基因。

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