枇杷园中酿酒酵母的筛选、分离及鉴定

朱安妮，康 琳，白菊红，谢印成，李丽娟

（成都农业科技职业学院，四川 成都 611130）

枇杷（Loquat）在我国已有2 000多年的种植历史，我国作为枇杷最大生产国，种植面积约17 万hm2，年产量约为100 万t。枇杷作为药食同源的水果，口感较好，具有润肺、养肺、祛痰作用，以此为原料开发的枇杷酒具有高附加值。枇杷酒的生产菌种主要为酿酒酵母，但现有文献表明，市售酿酒酵母对于枇杷酸度利用率低，存在发酵力不足等问题。因此，从枇杷中分离筛选出起酵快、发酵强、风味佳的专用酿酒酵母是非常有必要的。本研究利用微生物分离鉴定法，从枇杷原料及枇杷果园土壤中筛选功能性好、质量高的酿酒酵母，进行菌种发酵力测定，最终筛选出1 ～2 株最佳酿酒酵母用于后续产品加工。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枇杷、枇杷叶、土壤，均采集于成都简阳武庙镇团堡村枇杷种植基地。

YPD 培养基、TTC 培养基等生化试剂，杭州微生物试剂有限公司；琼脂粉，青岛海博；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

SWCJ1F 洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；MVS-83 立式压力蒸汽灭菌锅，松下冷链（大连）有限公司；LRH-250 生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；SPH-200D 超凡型小容量恒温培养摇床，上海世平实验设备有限公司；PHS-25 pH 计，上海雷磁有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 酿酒酵母的分离、纯化

对章之柱等[1]的方法进行改良，称取一定量的样品（枇杷、枇杷叶、土壤）于无菌试剂瓶中，稀释成不同质量浓度的悬浮液，涂布在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose，YPD），28 ℃培养72 h，根据菌落的形态和颜色进行初步筛选，对所得的酵母菌进行编号和保藏[2-3]。

1.3.2 酿酒酵母筛选

参考吴卓凡等[4]的方法，利用TTC 培养基培养酿酒酵母，典型的酿酒酵母表面有光泽、易挑取[5]，在TTC 平板上显红色[6]，根据上述特征筛选出有产酒精能力的酿酒酵母。将筛选出的酿酒酵母，按照5%量接入装有YPD 的杜氏小管中，28 ℃培养8 h，期间隔2 h 观察各菌株的产气量，记录初筛酵母菌株的起酵时间、产气速度，筛选出起酵快、产气良好的菌株。

1.3.3 酿酒酵母发酵特性研究

（1）酿酒酵母高糖耐受测定。以葡萄糖为原料调节16°Bé、18°Bé、20°Bé、22°Bé 的YPD 培养基，5%接种量接种待测酿酒酵母，在28 ℃、150 r·min-1条件下培养30 h，对比各菌株在不同葡萄糖浓度中的活菌数[7]。

（2）酿酒酵母酸度耐受性能测定。取菌悬液，按5%接种量接种于无菌YPD 中，调节培养基的pH 值为1.6、1.8、2.0、2.2， 在28 ℃、150 r·min-1培养 30 h，对比各菌株在不同pH 溶液中的活菌数。

（3）乙醇耐受性能测定。取菌悬液，按5%接种量接种在无水乙醇体积分数分别为10%、12%、14%、16%的YPD 培养基中，在28 ℃、150 r·min-1培养30 h，对比各菌株在不同酒精浓度中的活菌数。

2 结果与分析

2.1 酿酒酵母分离与筛选

通过YPD 培养基分离筛选后，涂布浓度为10-4的平板，约有100 ～150 个单菌落，绝大部分单菌落在TTC 培养基上显色良好，呈红色，单菌落数约为85%，将初筛的菌株全部用甘油保菌，-20 ℃保存。

从枇杷及土壤中共筛选出83 株酿酒酵母，编号P1 ～83，接种YPD 杜氏小管后观察产气情况，单菌落产气情况如表1。筛选的菌种中，约有3 株酵母菌株产气快，产气最快的8 h 开始，12 h 以内产满整个杜氏小管，约有23 株酿酒酵母培养18 h 以上未产气，其他大部分的菌株在12 ～18 h 内产气，约为60 株，其中7 株酿酒酵母12 h 内产气量超过杜式小管90%。由此，筛选出7 株发酵良好、起酵快的酵母菌株，6 株来源于枇杷果实，1 株来源于枇杷果园，可见自然发酵后发酵能力强的菌株大致得到富集，将分离筛选的7 株酿酒酵母菌株进行发酵特性鉴定，7 株菌株分别命名为PP1 ～PP6、TR1。

表1 酿酒酵母杜氏小管发酵筛选结果

2.2 酿酒酵母发酵特性

2.2.1 酿酒酵母高糖耐受测定

果酒发酵需要调整发酵果汁的甜度，但糖类会增加环境的渗透压，从而抑制酵母的生长，因此应筛选出耐高糖的酿酒酵母。本实验中对比各菌株在糖度16°Bé、18°Bé、20°Bé、22°Bé 的活菌数， 图1结果显示，PP1、PP4、PP5、PP6、TR1 这5 株酿酒酵母的耐受能力相对较强，在4 个糖度梯度下的活菌数平均值差异小，糖耐受能力均较为优异，PP2、PP3 两株酿酒酵母在22°Bé 耐糖性能较弱。

图1 酿酒酵母在不同葡萄糖浓度下的活菌数

2.2.2 酿酒酵母高酸耐受性能测定

高酸条件可以抑制杂菌的生长，但不影响酿酒酵母的生长，因此，需要筛选出耐酸且风味良好的酿酒酵母。从图2 可以看出，7 株菌株对于pH 耐受性差异较大，PP2 耐pH 能力最差，仅在pH 大于2.0环境下生长；PP3 在pH 为1.6 环境中不生长，其他3 种pH 条件均能生长；PP1、TR1 在4 种pH 条件下均生长，但在pH 为1.6、1.8 的酒精浓度环境下菌株生长情况不佳；PP4、PP5、PP6 在4 种pH 环境下生长良好，但在pH 为1.6 环境活菌数略低于其他pH条件，具有一定的耐酸能力。

图2 酿酒酵母对不同pH 下活菌数

2.2.3 乙醇耐受性能测定

发酵酒的生产主要利用酿酒酵母在发酵过程中产生酒精制得，但高浓度的酒精会抑制酵母活性，因此本试验利用筛选出的7 株菌株在不同酒精浓度下培养，拟筛选出酒精耐受能力强的菌株。由图3 可以看出，7 株菌株对于酒精耐受性差异较大，PP2 耐酒精能力最差，仅在酒精浓度低于12%的环境生长，在14%、16%条件下不生长，PP3、PP6 和TR1 在4种酒精浓度条件下均生长，但在14%、16%的酒精浓度环境下菌株生长情况较其他酒精浓度弱，PP1、PP4、PP5 在4 种酒精浓度条件下生长良好，耐酒精能力突出。

图3 酿酒酵母不同酒精浓度下活菌数

3 结论

本实验从枇杷生产基地的土壤及果实分离、筛选、鉴定，最终获得1 ～2 株适用于枇杷果酒生产的专业酵母。通过培养基分离筛选出83 株酿酒酵母，通过产气试验淘汰产气不佳的76 株酿酒酵母，筛选出7 株起酵快、产气快的酿酒酵母，其中6 株来源于枇杷果实样品，1 株来源于枇杷土壤样品，分别编号PP1 ～PP6、TR1。7 株菌株经过高糖耐受试验、高酸耐受试验、酒精耐受试验发酵力试验验证，PP4、PP5 两株酿酒酵母耐糖性、耐酸性、耐酒精能力较强。筛选枇杷果酒生产专用菌株有利于发展枇杷发酵产品市场，具有较好的市场前景。在本实验基础上，后续将筛选出的2 株酿酒酵母应用在枇杷果酒的生产过程中，探索和优化枇杷酒的生产工艺，为枇杷果酒产品开发奠定理论基础。