白芥子散的质量标准研究*

范晓良，张纯，郭志丽，阮伟峰，方瑞华

(1.浙江中医药大学附属嘉兴中医院药学部，嘉兴 314001；2.嘉兴市感染性疾病及细菌耐药研究重点实验室，嘉兴 314001；3.嘉兴市食品药品与产品质量检验检测院中药室，嘉兴 314001)

白芥子散源自清代张璐所著《张氏医通》[1]，是临床上广泛用于防治哮喘的穴位贴敷基本方。经临床实践，多数患者(包括儿童)经贴敷治疗后体质有不同程度改善[2]。现代研究表明，其可有效调解抑制Th2反应，降低血清中单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素4、白细胞介素13、免疫球蛋白和肿瘤坏死因子水平，使Thl/Th2趋于平衡而起到防治哮喘的功效[3-5]。

该方药在临床应用过程中常引起皮肤变态反应，除与贴敷时间、患者体质等因素相关外[6-7]，与其自身药物质量也有重大关系，但目前对该方药的研究多集中于临床应用、疗效机制、制剂改进[8]等方面，而对其质量控制方面的研究却鲜有报道。有人仅以薄层色谱法鉴别了其中部分药物，或仅建立了某个单一成分的测定方法[9-10]。另外，在穴位贴敷干预哮病的中医治未病实践指南中[11]，虽明确推荐了该方药的组成(白芥子、延胡索、细辛、甘遂)，比例及制备工艺，但未对其质量标准作出要求。故对其进行全面质量控制，建立完善的质量标准对保障其临床用药安全具有重要意义。本研究除对白芥子散的水分、总灰分进行测定外，建立了白芥子等4味药物的显微、薄层鉴别法及芥子碱硫氰酸盐、细辛脂素两个主要成分的同时测定方法，为建立白芥子散的质量标准提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 Eclipse E200MV型生物显微镜(日本尼康公司)；Waters E2695-2998高效液相色谱系统，DAD检测器(美国WATERS公司)；XS205DU型电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司，感量：0.01 mg)；Mili-Q Reference超纯水系统(美国MILLIPORE公司)；USC-502 型超声波清洗器(上海波龙电子设备有限公司)；硅胶G薄层板(德国默克公司)等。

1.2试药 芥子碱硫氰酸盐(含量：98.6%，批号：AF8100802)、细辛脂素(含量：98.9%，批号：AF8031912)、大戟二烯醇(含量：98.5%，批号：18041403)均购自于成都埃法生物科技有限公司；延胡索乙素(含量99.8%，批号：110726-201516)、延胡索对照药材(批号：120928-201609)、细辛对照药材(批号：121204-201606)、甘遂对照药材(批号：121042-201605)均购自于中国食品药品检定研究院。白芥子散(12批样品均为自制，批号分别为180712，180713，180717，180720， 180723， 180724， 180726，180727，180802，180807，180810，180812)。白芥子、延胡索、细辛、甘遂药材均由嘉兴东方国药饮片有限公司提供(批号分别为181102，190226，190323，181209)，经嘉兴市食品药品与产品质量检验检测院陈叶青副主任中药师鉴定为《中华人民共和国药典》规定品种。

2 方法与结果

2.1水分及总灰分 参照《中华人民共和国药典》2015年版四部0832项下第二法(烘干法)及灰分测定法下的第一项“总灰分测定法”分别进行实验[12]，各平行操作3次，取平均值。结果显示12批白芥子散的水分含量为9.9%～14.8%，平均值为11.82%；总灰分为2.5%～3.7%，平均值为3.14%。

2.2显微鉴别 取样品细粉适量制片，置显微镜下观察。可见白芥子种皮栅状细胞成片，表面观呈类多角形，常与下皮细胞重叠；延胡索的糊化淀粉粒团块，多数呈类圆形；大量细辛草酸钙砂晶存在，测得直径约5 μm；甘遂细长木纤维明显，扭曲状。12批次样本中均可见上述显微特征，见图1。

A.种皮栅状细胞(白芥子)；B.糊化淀粉粒(延胡索)；C.草酸钙砂晶(细辛)；D.木纤维(甘遂)。图1 白芥子散显微鉴别(40×10) A.seed coat palisade cells (Semen Sinapis Albae)；B.gelatinized starch granules (Corydalis Rhizoma)；C.calcium oxalate sand crystals ( Asari Radix et Rhizoma)；D.wood fiber (Kansui Radix).Fig.1 Microscopic characteristics of Baijiezi San(40×10)

2.3薄层色谱鉴别

2.3.1白芥子的薄层鉴别 取批号为180712的白芥子散粉末3.5 g，加甲醇50 mL，30 ℃恒温条件下超声(250 W，50 kHz)处理1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5 mL溶解，作为供试品溶液；取除白芥子的其他药材，按比例制备成缺白芥子的阴性对照样品，按供试品溶液制备方法制成缺白芥子阴性溶液；取白芥子对照药材1.0 g，同法制成白芥子对照药材溶液；另取芥子碱硫氰酸盐对照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述溶液各5～10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(3.5：5：1：0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，置日光下检视。结果见图2。

1.白芥子对照药材；2.芥子碱硫氰酸盐；3.供试品；4.阴性样品。图2 白芥子薄层色谱图 1.reference drug of Semen Sinapis Albae；2.sinapine thiocyanate；3.sample；4.negative sample.Fig.2 TLC chromatogram of Semen Sinapis Albae

2.3.2延胡索的薄层鉴别 取批号为180712的白芥子散粉末5.0 g，加甲醇50 mL，30 ℃的恒温条件下超声(250 W，50 kHz)处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL溶解，加浓氨试液调至碱性，用乙醚振摇提取3次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液；取除延胡索的其他药材，按比例制备成缺延胡索的阴性对照样品，并按供试品溶液制备方法制成缺延胡索阴性溶液；同时另取延胡索对照药材1.0 g，同法制成延胡索对照药材溶液；再取延胡索乙素对照品，加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。吸收上述溶液各2～3 μL，分别点于同一用G薄层板上，以甲苯-丙酮(9：2)为展开剂，展开，取出，晾干，以碘蒸汽熏至显色，置紫外光灯(365 nm)下检视。结果见图3。

1.延胡索对照药材；2.延胡索乙素；3.供试品；4.阴性样品。图3 延胡索薄层色谱图 1.reference drug of Corydalis Rhizoma；2.tetrahydropalmatine；3.sample；4.negative sample.Fig.3 TLC chromatogram of Corydalis Rhizoma

2.3.3细辛的薄层鉴别 取批号为180712的白芥子散粉末3.5 g，加甲醇20 mL，30 ℃的恒温条件下超声(250 W，50 kHz)处理45 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL溶解，作为供试品溶液；取除细辛的其他药材，按比例制备成缺细辛的阴性对照样品，按供试品溶液制备方法制成缺细辛阴性溶液；另取细辛对照药材1.0 g，同法制成对照药材溶液。再取细辛脂素对照品加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)乙酸乙酯(4：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，放置于105 ℃至斑点显色清晰。结果见图4。

1.细辛对照药材；2.细辛脂素；3.供试品；4.阴性样品。图4 细辛薄层色谱图 1.reference drug of Asari Radix et Rhizoma；2.Asarinin；3.sample；4.negative sample.Fig.4 TLC chromatogram of Asari Radix et Rhizoma

2.3.4甘遂的薄层鉴别 取批号为180712的白芥子散粉末3.5 g，加乙醇10 mL，30 ℃的恒温条件下超声(250 W，50 kHz)处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1 mL溶解，作为供试品溶液；取除甘遂的其他药材，按比例制备成缺甘遂的阴性对照样品，按供试品溶液制备方法制成缺甘遂阴性溶液；另取甘遂对照药材1.0 g，同法制成对照药材溶液；再取大戟二烯醇对照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60 ℃)-丙酮(10：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果见图5。

1.甘遂对照药材；2.大戟二烯醇；3.供试品；4.阴性样品。图5 甘遂薄层色谱图 1.reference drug of Kansui Radix；2.euphadienol；3.sample；4.negative sample.Fig.5 TLC chromatogram of Kansui Radix

2.4定量测定

2.4.1对照品储备液的制备 精密称取芥子碱硫氰酸盐、细辛脂素对照品适量，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每毫升中分别含498.82，395.14 μg的混合对照品储备液。

2.4.2供试品溶液的制备 精密称取批号为180712的白芥子散粉末0.5 g，置150 mL锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声处理(功率250 W，频率50 kHz)40 min，取出，冷却至室温，加甲醇补足减失的质量。摇匀，过滤，取续滤液，离心，经孔径0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4.3阴性样品溶液的制备 按白芥子散处方比例，分别制备缺白芥子、细辛的阴性对照样品，同“2.4.2”项下方法，制备阴性对照品溶液。

2.4.4色谱条件 色谱柱为X BridgeTMC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～20 min，5%→30%A；20～50 min，30%→60%A，50～60 min，90%A)；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；样品及对照品进样量：10 μL；芥子碱硫氰酸盐及细辛脂素检测波长均为280 nm。

2.4.5专属性实验 分别精密吸取上述混合对照品储备液、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱峰面积。结果示目标成分的色谱峰与相邻色谱峰分离度>1.5，表明分离良好，且混合对照品溶液及供试品溶液中芥子碱硫氰酸盐、细辛脂素对应的保留时间处，阴性对照品溶液无吸收峰出现，因此该方法专属性较好。见图6。

A.缺白芥子阴性对照品溶液；B.缺细辛阴性对照品溶液；C.混合对照品溶液；D.供试品溶液。1.细辛脂素；2.芥子碱硫氰酸盐。图6 白芥子散高效液相色谱图 A.negative control solution without Semen Sinapis Albae；B.negative control solution without Asari Radix et Rhizoma；C.mixed reference solution；D.sample solution；1.asarinin；2.sinapine thiocyanate.Fig.6 HPLC chromatograms of Baijiezi San

2.4.6线性关系考察 精密吸取上述混合对照品储备液适量，分别以甲醇稀释2倍、5倍、10倍、50倍、100倍，获得包括对照品储备液在内的6个不同浓度对照品液，按“2.4.4”项下色谱条件操作，以对照品浓度X(μg·mL-1)为横坐标绘制标准曲线，以测得的峰面积Y为纵坐标，计算回归方程分别为：芥子碱硫氰酸盐：Y=27 564X-49 685 (r=0.999 8)；细辛脂素：Y=12 279X+7 052.4 (r=0.999 9)，表明芥子碱硫氰酸盐、细辛脂素分别在4.99～498.82，3.951～395.1 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。

2.4.7精密度实验 在室温条件下，取“2.4.1”项下制备的对照品储备溶液，按“2.4.4”项下色谱条件，连续进样6次，结果显示芥子碱硫氰酸盐、细辛脂素峰面积的RSD分别为0.84%和1.53%，表明仪器的精密度良好。

2.4.8重复性实验 取白芥子散样品(批号：180712)，按“2.4.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.4.4”项下色谱条件操作并测定峰面积，计算含量，结果芥子碱硫氰酸盐、细辛脂素平均含量分别为2.0和0.75 mg·g-1，RSD分别为2.23%和1.06%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.4.9稳定性实验 取同一份样品溶液(批号：180712)，依次于样品配制后0，6，8，12，24，36 h进样，测定峰面积并计算RSD。结果显示芥子碱硫氰酸盐、细辛脂素峰面积的RSD分别为0.90%和2.25%(n=6)，表明36 h内供试品溶液的稳定性良好。

2.4.10加样回收实验 精密称取已知含量的白芥子散样品(批号：180712)9份，每份约0.25 g，分别按已知含量的50%，100%，150%加入对照品，并按照“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.4.4”项下色谱条进行测定，计算回收率。最终得芥子碱硫氰酸盐的平均加样回收率为99.58%，RSD为1.17%，细辛脂素的平均加样回收率为101.92%，RSD为1.55%，表明该方法回收率良好。结果见表1。

表1 芥子碱硫氰酸盐和细辛脂素的加样回收率实验结果Tab.1 Recovery test results of sinapine thiocyanate and asarinin n=9

2.4.11含量测定 取12批白芥子散样品，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.4.4”项色谱条件下进样分析，记录芥子碱硫氰酸盐、细辛脂素峰面积并计算含量。结果见表2。

表2 12批次白芥子散芥子碱硫氰酸盐及细辛脂素含量结果 Tab.2 Content determination results of sinapine thiocyanate and asarinin in 12 batches of Baijiezi San mg·g-1，n=9

3 讨论

3.1显微与薄层鉴别 白芥子散4种药材的显微特征较多，本研究选择了白芥子(种皮栅状细胞)、延胡索(糊化淀粉粒)、细辛(草酸钙砂晶)、甘遂(木纤维)的特有显微特征作为观察要点，并同时观察了对应的缺味阴性样品，在阴性样品中并未见对应药材的特有显微特征，表明此方法有效可行。

在白芥子、延胡索的薄层色谱鉴别过程中，展开剂的选择参照了《中华人民共和国药典》2020年版介绍的方法[13]，分离结果均较满意，而在细辛及甘遂的薄层色谱鉴别中，以《中华人民共和国药典》推荐的展开剂进行实验时，两者的薄层色谱斑点分离均较差。最终笔者发现以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(4：1)为展开剂时，细辛各成分分离结果令人满意；以石油醚(30～60 ℃)-丙酮(10：1)为展开剂时，甘遂的各成分斑点分离较好。

3.2含量测定指标的选择 白芥子散中芥子碱硫氰酸盐目前已证实具有平喘功效[14]，为主要有效成分指标之一，而细辛脂素具有促进其他活性成分经皮渗透而利于哮喘的治疗[15]，且《中华人民共和国药典》规定，芥子碱硫氰酸盐、细辛脂素分别是白芥子和细辛的质量控制成分，因此本研究选择芥子碱硫氰酸盐及细辛脂素为含量测定指标。

3.3限量标准的建议 根据测定结果及《中华人民共和国药典》对于中药质量标准研究制定技术要求，并结合实际情况，建议白芥子散的水分不得超过15.00%，总灰分不得超过5.00%。考虑到芥子碱硫氰酸盐及其水解产物对皮肤有强烈的刺激反应，对其进行限量实有必要，故建议其含量不得少于2.0 mg·g-1且不得超过4.0 mg·g-1，细辛脂素含量不得少于0.60 mg·g-1，上述结论可作为白芥子散质量标准的参考依据。