m6A修饰酶METTL16在卵巢中的表达及其作用机理挖掘

Abdelkerim Barh Touna，董 莹，杨志新，杨丽华

(昆明医科大学第二附属医院 妇科，云南 昆明 650000)

卵巢癌是女性生殖器常见的三大恶性肿瘤之一，其致死率居妇科恶性肿瘤首位，严重威胁妇女生命和健康。N6-甲基腺苷酸(N6-methyladenosine，m6A)是mRNA和lncRNA中影响RNA代谢的一种重要修饰。甲基转移酶样蛋白16(methyltransferase16，METTL16，又名METT10D)是新近证实的一种m6A RNA甲基转移酶，与胃癌[1]、肺癌[2]、前列腺癌[3]等多种癌症的发生及发展有关，但未见其在卵巢癌中的研究报道。本研究通过收集Oncomine数据库中关于METTL16在卵巢癌研究的相关数据集，对其进行探索，同时通过GEPIA、Kaplan-Meier等数据库分析METTL16在卵巢癌中的表达及其对卵巢癌患者生存的影响，随后应用STRING、Metascape数据库进一步探究METTL16共表达蛋白及其在卵巢癌发生发展中可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 Oncomine数据库中提取METTL16在卵巢癌中表达的数据

登陆Oncomine数据库页面(http：//www.on-comine.org)，根据以下条件进行筛选：(1)Gen：METT10D；(2)Cancer Type：Ovarian cancer；(3)Data Type：mRNA；(4)Analysis Type：Cancer vs. Normal Analysis；(5)临界值设定(P<0.05)；Fold Change：All；Gene Rank：All。探索METTL16在卵巢癌中的差异表达情况。

1.2 GEPIA数据库验证METTL16在Oncomine数据库中的表达结果及其表达水平与卵巢癌临床病理分期的关系

进入GEPIA数据库(http：//gepia.cancer-pku.cn/)，设置限定条件：(1)Gene：METTL16；(2)p-value Cutoff：0.01；(3)Datasets Selection：OV；(4)匹配正态数据：匹配 TCGA 法线和 GTEx 数据。

1.3 应用Kaplan-Meier Plotter进行METTL16在卵巢癌中的生存分析

登录Kaplan-Meier Plotter数据库(http：//kmplot.com/analysis/)，选择“start KM plotter for Ovarian cancer”选项卡，设置限定条件为(1)Gene symbol：METTL16(Affymetrix ID：226744_at)；(2)Survival：无进展生存期(progression-free survival，PFS)、总生存期(Overall survival，OS)。探索METTL16在卵巢癌中的表达及其对卵巢癌患者生存的影响。

1.4 METTL16基因相关蛋白互作关系及富集分析

登录STRING主页，设置限定条件：(1)Protein Name：METTL16：(2)Organism：Homo sapiens，构建YTHDC1相关蛋白网络图。登陆Metacape(https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1)，设置限定条件：(1)添加相关蛋白Gene Symbol；(2)Analysis as species：H.sapiens(121)进行相关蛋白富集分析。

2 结果

2.1 Oncomine数据库中METTL16在卵巢癌中的表达

Oncomine数据库中关于METTL16在卵巢癌中表达的相关研究主要有7项，与正常卵巢组织相比，METTL16在卵巢癌组织中呈现低表达，且差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.2 GEPIA数据库中METTL16在卵巢癌中的表达及其表达水平与卵巢癌临床病理分期的关系

GEPIA数据库中进一步验证METTL16在卵巢癌组织中的表达，分析了肿瘤组织426例，正常组织86例，METTL16在卵巢癌组织中呈现低表达，分期越晚表达越低，结果有统计学意义(P<0.05)，见图2、图3。

图2：METTL16在卵巢癌组织中的表达

图3 METTL16基因表达与卵巢癌临床病理分期的关系

2.3 METTL16基因与卵巢癌患者的生存关系分析

在Kaplan-Meier 数据库中进行卵巢癌患者生存分析，发现METTL16基因低表达组无病生存率、总生存率均显著高于高表达组(P=0.00024)，见图4。

图4 METTL16表达卵癌患者生存分析

2.4 METT16相关互作蛋白及其富集分析

在STRING网站中构建METTL16基因相关蛋白互作网络图，METTL16主要相关蛋白有10个，分别为MEPCE，SGSM2，CLUH，METTL14，SRR，BRMS1L，SMG6，DCP1B，RBM34，METTL3，见图5。将以上蛋白进行富集分析，主要富集在RNA甲基化和mRNA分解代谢过程，见图6。

图5 METTL16相关蛋白网络关系图

图6 METTL16相关蛋白参与的富集过程

3 讨论

m6A甲基化在卵巢癌的发生、发展、侵袭和耐药性中起到重要作用[4]。METTL16 是人类细胞 RNA 修饰领域的新兴参与者，最初被认为是一种核糖体 RNA 甲基转移酶，现有研究显示它可以结合并甲基化 MAT2A mRNA和 U6 snRNA[5]，另外METTL16还被证明可以结合 MALAT1 长链非编码 RNA 和其他几种 RNA[7]。本研究通过在Oncomine数据库分析发现METTL16在卵巢癌中表达明显低于正常组织，且这一结果在GEPIA数据库中得到了验证，同时，METTL16与卵巢癌临床分期各组间有差异，临床病理分期较早的卵巢癌中表达更高，且METTL16基因低表达者无病生存率及总生存率显著升高，提示METTL16基因在卵巢癌可能发挥抑癌基因作用。为进一步探究METTL16在卵巢癌中的作用机理，我们发现MEPCE，METTL13等10个为METTL16的互作蛋白，进行富集分析后发现这些蛋白主要富集在RNA甲基化和mRNA分解代谢过程。对上述10个蛋白了解后发现，METTL16与METTL3同源，可以结合于U6 snRNA，导致U6 核微小核糖核蛋白颗粒(small nuclear ribonucleoprotein particles，snRNP发生m6A甲基化修饰，从而影响U6 snRNP对mRNA前体的剪接[6]，Ma Zhao[7]等人发现METTL3总体水平升高是子宫内膜样上皮性卵巢癌患者生存期相关的独立因素，Hua[8]等人发现METTL3通过促进AXL(Tyro3/Axl/Mer)的翻译和上皮细胞-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)，在卵巢癌的发生发展和/或侵袭性中发挥重要的致癌作用，而我们的研究中，METTL3与METTL16互为互作蛋白，METTL16在卵巢癌中则表达为抑癌基因，因此二者可能对卵巢癌的发生发展起到互相拮抗的作用。

综合以上结果及相关分析，本研究认为METTL16可能通过结合并甲基化mRNA和snRNA干预mRNA分解代谢过程，同时通过与METTL3互作蛋白相互拮抗，在METTL16高表达时通过干预RNA甲基化过程抑制METTL3的表达，使癌细胞增殖减缓从而发挥抑癌基因作用。METTL16作为新近证实的一种m6A RNA甲基转移酶，其在卵巢癌中的作用机制、临床意义等，还需要进一步的实验来进行验证。