功能矫形对安氏Ⅱ类错牙合模型大鼠髁突软骨生长发育及VEGF表达的影响

[摘要]目的：探討安氏Ⅱ类错牙合模型大鼠在接受功能矫形后其髁突软骨生长发育及VEGF表达的情况。方法：安氏Ⅱ类错牙合模型大鼠30只，随机分为实验组（n=15，佩戴咬合前导矫治器，连续佩戴30 d），对照组（n=15，不佩戴咬合前导矫治器）。处死大鼠，观察两组大鼠双侧颞下颌关节髁突软骨前、中、后部生长发育情况、软组织形态、VEGF阳性表达、VEGF蛋白表达。结果：建模前两组髁突软骨厚度比较，差异无统计学意义（P>0.05），建模后实验组各部厚度明显较对照组更厚，差异具有统计学意义（均P<0.05）。实验组软骨增殖层细胞数量较对照组有所上升，细胞核有明显变大，成熟层细胞和细胞间质出现增长，肥大层细胞数量、分泌量与对照组相比呈增长趋势，软骨中部、后部纤维层变化不明显。VEGF在细胞浆和细胞膜中表达为棕黄色，两组后部阳性细胞数均高于中部，中部阳性细胞数均高于前部，其中，对照组髁突软骨前部、中部、后部VEGF蛋白阳性数均低于实验组。两组髁突软骨VEGF蛋白表达在前、中、后部呈阶梯状增长，各部对比差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论：功能矫形可促进安氏Ⅱ类错牙合大鼠下颌髁突软骨局部生长，提高VEGF表达。

[关键词]血管内皮生长因子;安氏Ⅱ类错牙合;功能矫形;髁突软骨;SD大鼠

[中图分类号]R783.5    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2022）03-0103-04

Effects of Functional Orthopedics on the Growth and Development of Condylar Cartilage and the Expression of VEGF in Angel's Class Ⅱ Malocclusion Model Rats

ZHENG Xinyu

（Department of Stomatology，Heze Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shandong Province，Heze 274000，Shandong，China）

Abstract： Objective To investigate the growth and development of condylar cartilage and the expression of VEGF in Angel's Class Ⅱ malocclusion model rats after functional orthopedics. Methods Thirty Angle Class Ⅱ malocclusion model rats were randomly divided into experimental group （with occlusal guide appliance for 30 days） and control group （without occlusal guide appliance）. The rats were sacrificed， and the growth and development of the anterior， middle and posterior parts of the bilateral temporomandibular joint condylar cartilage， soft tissue morphology， VEGF positive expression and VEGF protein expression were observed in the two groups of rats. Results  Before modeling，there was no significant difference in the thickness of condylar cartilage between the two groups （P>0.05）. After modeling， the thickness of each part in the experimental group was significantly thicker than that in the control group （all P<0.05）. Compared with the control group， the number of cells in the proliferative layer of the cartilage in the experimental group increased， the nuclei became larger， the mature layer cells and intercellular substance increased， and the number and secretion of the hypertrophic layer cells increased compared with the control group. The fibrous layer did not change significantly. The expression of VEGF in cytoplasm and cell membrane was brownish yellow. The number of positive cells in the rear of the two groups was higher than that in the middle， and the number of positive cells in the middle was higher than that in the front. Among them， the positive number of VEGF protein in the front， middle and rear of condylar cartilage in the control group was lower than that in the experimental group. The expression of VEGF protein in the anterior， middle and posterior parts of the condylar cartilage in the two groups increased in a step-like manner， and the differences in each part were statistically significant （all P<0.05）. Conclusion Functional orthopedics can promote the local growth of mandibular condyle cartilage and increase the expression of VEGF in Angle Class Ⅱ malocclusion rats.

Key words： vascular endothelial growth factor; Angle Class Ⅱ malformation; functional orthopedics; articular cartilage; SD rats

安氏Ⅱ类错牙合畸形是我国常见的一种错牙合畸形，严重的错牙合畸形表现为牙齿排列异常，或者骨骼异常改变[1]。功能性矫治器能帮助下颌前伸，促进髁突软骨的成长和重建，使下颌位置后缩得以纠正，下颌发育不足得到改善，在矫正儿童生长发育期间牙齿畸形效果较好[2]。近年来，大量临床研究发现固定类功能矫治器也适用于成人，治疗效果也很好，大多数学者认为下颌骨功能整形扩张可以促进髁突软骨的成长和代谢，延长下颌骨的长度，达到Ⅱ类错牙合矫正的目的[3-4]。血管内皮生长因子（VEGF）作为重要的血管新生因子，可通过旁分泌产生作用，刺激血管内皮细胞的有丝分裂，提高血管内皮细胞的渗透性，促进血管新生，形成调节骨[5]。此外，VEGF涉及胚胎发生中的血管新生的过程以及炎症及创伤的治愈過程，近年来，在长骨中也有VEGF的发现，软骨细胞及成骨细胞中也有VEGF表达，长骨VEGF在软骨内骨形成中发挥重要作用[6]。有研究发现，在生长中的大鼠髁突和颞骨中检测出VEGF表达，下颌骨髁突中的软骨细胞发现了VEGF，可刺激血管形成[7]。由此本文通过建立安氏Ⅱ类错牙合模型大鼠，探讨功能矫形对安氏Ⅱ类错牙合模型大鼠髁突软骨生长发育及VEGF的表达的作用。

1  材料和方法

1.1 模型建立：自广东省医学实验动物中心，购买9周龄的SD大鼠30只，体重为（239.91±21.86）g。30只大鼠采用速眠新Ⅱ麻醉（腹腔注射0.3～0.8 ml/kg），利用粘接材料将斜面导板粘固于上切牙，调整下颌切牙与斜面导板的接触面，斜面导板与上颌平面呈约25°角，以保证下颌不发生偏斜。通过固位钩将链状橡皮圈经鼻上颌复合体与防护颈圈连接，使得斜面导板获得稳定的固位，防护颈圈能够有效地防止大鼠前爪对装置的破坏及对面部组织的伤害。见图1。

1.2 分组：将大鼠随机分为实验组（佩戴咬合前导矫治器）15只，持续佩戴30 d;对照组（不佩戴咬合前导矫治器）15只，建模结束所有动物自由进食饮水。

1.3 观察两组髁突软骨前、中、后部的4个指标：①生长发育情况;②组织形态;③VEGF阳性表达情况;④VEGF蛋白表达情况。

1.3.1 光镜观察软骨生长发育情况：实验组、对照组动物饲养30 d后进行深度麻醉处死，暴露大鼠颧弓，取出双侧颞下颌关节，对关节盘前带最厚处、中带最厚处、后带最厚处进行厚度测量，采用Olympus CX31型光学显微镜，在40倍镜下观察，并使用Pixera PVC100C系统采集图片，电子测量尺测定，对实验组、对照组的髁突软骨厚度进行记录。

1.3.2 HE染色观察软骨组织形态：将取出的双侧颞下颌关节进行甲醛溶液固定，乙醇溶液进行脱水，石蜡包埋后取出髁突纵向切片5 μm，用山羊血清进行封闭处理，苏木精和伊红染色液复染分别为6～8 min和10 s，于显微镜下观察双侧颞下颌组织形态。

1.3.3 免疫组化染色观察VEGF阳性表达情况：将取出的双侧颞下颌关节进行甲醛溶液固定，石蜡包埋后取出髁突纵向切片5 μm，乙醇溶液实施脱水，滴加抗原消化液、修复液，山羊血清实施封闭，按1∶50比例加入一抗及二抗，用DAB实施染色，蒸馏水终染，再苏木素衬染，脱水后可封片，于显微镜下观察到髁突软骨VEGF表达为棕（褐）色即为阳性。VEGF阳性表达率检测方法：组织切片收集后，随机在髁突软骨前部、中部、后部各抽取切片，运用光学显微镜对髁突软骨前、中、后部进行观测，每部分选择连续3个64px×64px大小的区域，计数各区域VEGF棕色深染的阳性细胞数，最终得出其阳性表达率。

1.3.4 Western Blot检测VEGF蛋白表达：石蜡包埋的髁突软骨组织，用PBS溶液洗涤三次，切碎处理加入1ml裂解液，测定组织中的蛋白质浓度，用100V的SDS-PAGE电泳，采用Bradford法实施定量，电泳后收集产物，转至PVDF膜上，10%山羊血清封闭0.5 h。一抗过夜孵育4℃条件下，二抗室温下孵育1 h，洗膜在室温下进行，次数3次，β-actin作内参，用Quantity one 4.0软件分析VEGF蛋白表达。

1.4 统计学分析：用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计和分析，所有数据采用x¯±s表示，两组对比行t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2  结果

2.1 两组髁突软骨生长发育情况：建模前两组髁突软骨各部厚度对比，差异无统计学意义（P>0.05）;建模后实验组髁突软骨各部厚度均较对照组更厚，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 两组髁突软骨组织形态对比：实验组软骨前、中、后部增殖层细胞数量较对照组均有所上升，细胞核有明显变大，成熟层细胞和细胞间质出现增长，肥大层细胞数量、分泌量与对照组相比呈增长趋势，软骨中部、后部纤维层变化不明显。见图2。

2.3 免疫组化染色：VEGF在细胞浆和细胞膜中表达为棕黄色，两组后部阳性表达率均高于中部，中部阳性表达率均高于前部，其中，对照组髁突软骨前部、中部、后部VEGF蛋白阳性表达率均低于实验组。见图3。

2.4 两组大鼠髁突软骨前部、中部、后部的VEGF蛋白表达变化：两组髁突软骨前部VEGF表达对比，差异无统计学意义（P>0.05）;实验组大鼠髁突软骨中部和后部VEGF表达均较对照组显著升高，差异具有统计学意义（t=3.675，6.057，均P<0.05）。两组髁突软骨前部VEGF蛋白表达最低，中部蛋白表达其次，后部蛋白表达最高，各部对比差异均有统计学意义（均P<0.05）。见图4。

3  讨论

诱导下颌前伸的功能性矫治器可用于矫正Ⅱ类错牙合[8]。骨髁突关节的髁突软骨和关节盘重建，反映外力对髁突产生的各种影响[9]。髁突软骨受到外力刺激，影响增殖细胞最终分化为成熟软骨细胞[10]。成熟的软骨细胞层连续分泌细胞外基质，在这个过程中逐渐分化成肥大层软骨细胞，与软骨下相邻的肥大层骨骼形成活化，软骨细胞钙化变成下层的骨组织。突出的组织持续成长，并且成年后也维持一定的重建能力[11]。而VEGF是下颌骨软骨的成长及发育的重要调节因子，VEGF在软骨和骨的接合部对血管内皮细胞起作用，促进血管形成，并诱导小血管向软骨肥大层生长，提供对髁突软骨成长和发育必要的营养物质[12]。

有研究证实，软骨内骨化的过程与软骨所受外力的变化密切相关，下颚前伸使下颌骨的位置发生变化，髁突软骨局部承受力发生改变，诱导软骨组织产生一系列生物学反应。有研究证实，下颚前伸、髁突变位后，促进钙化软骨中内骨化形成，导致肥大软骨细胞也呈钙化趋势且形成速度较快，细胞钙化成骨组织，因此髁突组织局部发育、生長加快[13-14]。笔者研究发现，功能矫形的大鼠髁突局部生长加快，软骨较对照组厚，软骨增殖层细胞数量较对照组有所上升，细胞核有明显变大，成熟层细胞和细胞间质出现增长，肥大层细胞数量、分泌量均呈增长趋势，软骨中部、后部纤维层变化不明显。结果提示功能矫形对髁突软骨生长发育具有明显的改善作用。这与之前的报道相符。

VEGF是软骨细胞凋亡、破骨细胞功能、细胞外基质变化、血管新生及骨骼形成的重要调整因子。VEGF可以通过调节血管形成来参与骨骼形成及骨组织治愈的过程，内因性VEGF可以促进血管形成、骨痂形成及钙化，伴随骨骼形成及骨膜下骨形成加速骨达到愈合的效果。有研究证实，小鼠VEGF基因的敲除后，阻碍血管侵入软骨，说明VEGF在软骨血管化的初期阶段及后期阶段发挥重要作用，并在关节软骨中发现大量的细胞死亡，说明VEGF表达水平与软骨的生长十分重要[15]。本研究中，笔者观察到软骨中，VEGF的阳性表达及蛋白表达从前部到后部均递增，且功能矫形后的大鼠相对于对照组，VEGF在软骨不同部位的表达均显著升高。以上结果提示，功能矫形有助于提高大鼠软骨VEGF表达，以促进软骨的形成。

综上所述，功能矫形可促进安氏Ⅱ类错牙合大鼠下颌髁突软骨局部生长，提高VEGF表达。

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[收稿日期]2020-11-06

本文引用格式：郑新宇.功能矫形对安氏Ⅱ类错牙合模型大鼠髁突软骨生长发育及VEGF表达的影响[J].中国美容医学，2022，31（3）：103-106.