0.1%纳米银溶液对慢性根尖周炎大鼠RORγT、IL-17及Foxp3表达的影响

孙新新 迪丽努尔·阿卜拉 刘涛 罗甜甜 王邦耀 陈越 刘奕杉

[摘要]目的：探討0.1%纳米银溶液用于根管封药对慢性根尖周炎大鼠RORγT、IL-17、Foxp3表达的影响。方法：对40只雄性大鼠双侧下颌第一磨牙开髓建立根尖周炎模型，术后2周处死4只大鼠用RVG+HE判断造模成功，将剩余36只大鼠随机均分为空白对照组（K组），氢氧化钙组（Q组）及0.1%纳米银溶液组（N组）。于用药后7、14、21 d各组随机处死4只大鼠，免疫组织化学检测Foxp3表达，qRT-PCR检测RORγT、IL-17的表达。结果：免疫组化显示3组于用药7、14、21 d时Foxp3表达呈逐渐上升趋势，N、Q组均高于K组（P<0.05）。qRT-PCR显示，N组RORγT、IL-17表达在14、21 d均低于K组（P<0.05），21 d时，N较Q组IL-17表达无差异（P>0.05），RORγT表达有差异（P<0.05）。结论：0.1%纳米银溶液用于根管封药效果好，可降低RORγT、IL-17水平，促进Foxp3的表达。

[关键词]0.1%纳米银溶液;慢性根尖周炎;RORγT;IL-17;Foxp3

[中图分类号]R781.34    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2022）03-0087-03

Effects of 0.1% Nano-silver Solution on the Expression of RORγT， IL-17 and Foxp3 in Rats with Chronic Periapical Inflammation

SUN Xinxin1，Dilinuer·ABULA1，LIU Tao2，LUO Tiantian1，WANG Bangyao1，CHEN Yue1，LIU Yishan1

[1.Department of Pediatric Stomatology-Oral Prophylaxis，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University（Affiliated Stomatological Hospital），Xinjiang Uygur Autonomous Region Institute of Stomatology，Urumqi 830000，China; 2.Medical Laboratory Center of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830000，Xinjiang，China]

Abstract： Objective To investigate the effect of 0.1% nano-silver solution as root canal sealing agent on the expression levels of RORγT， IL-17 and Foxp3 in rats with chronic periapical inflammation. Methods The model of periapical inflammation was established by opening the pulp of the first mandibular molars of rats. Two weeks after surgery， Hematoxylin-eosin （HE） staining was performed to judge the success of modeling. The rats were randomly divided into blank control group （K group）， calcium hydroxide paste group （Q group） and 0.1% nano silver solution group （N group）. Four rats in each group were randomly sacrificed on day 7， 14 and 21 after administration， and Foxp3 expression was detected by immunohistochemistry. Quantitative real-time polymerase chain reaction （QRT-PCR） was used to detect the expression of RORγT and IL-17. Results Immunohistochemistry showed that Foxp3 expression in group N was significantly higher than that in group K （P<0.05）， and increased gradually with the extension of medication time. QRT-PCR showed that the expression of RORγT and IL-17 in N group was lower than that in K group at 7， 14 and 21 days （P<0.05）， and decreased gradually with time. Conclusion  0.1% nano silver solution was effective for root canal sealing， which could reduce RORγT and IL-17 levels and promote Foxp3 expression.

Key words： 0.1% nano-silver solution; chronic periapical disease; RORγT; IL-17; Foxp3

慢性根尖周炎是牙齿根尖部及其周围组织的慢性炎症，主要由细菌感染引起，就诊率高，严重时可影响患者生活质量[1]。其主要病理表现是根尖周组织的炎症反应和骨质破坏，若能抑制炎症的发生，根尖周炎的进展便会被明显抑制。

氢氧化钙在根管消毒中至关重要，可有效清除病原体，防止疾病复发。但有研究表明，氢氧化钙渗入牙本质小管深度有限，封药后难以彻底清除[2]。纳米银作为一种新型抑菌材料，有较强渗透及杀菌作用，应用较为广泛[3]。研究发现，Th17和Treg细胞在慢性根尖周炎进展中分别发挥着相反的生物学作用。因此，本研究拟建立实验性根尖周炎模型，采用0.1%纳米银溶液用于根管封药治疗慢性根尖周炎，探讨其对根尖周组织中Th17型细胞因子（IL-17、RORγT）及Treg型细胞因子（Foxp3）的影响，以期为探寻新型根管消毒药物提供实验依据。

1  材料和方法

1.1 实验动物：选用40只5周龄SD雄性大鼠，体重（150±5）g（由新疆医科大学实验动物中心提供）。本研究经新疆医科大学生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会批准（批准号：IACUC20201225-23）

1.2 動物模型建立和分组：大鼠适应性饲养1周，腹腔注射10%水合氯醛（3 ml/kg），仰卧固定，1/4球钻对双侧下颌第一磨牙开髓，15#K锉清理。术后2周随机处死4只大鼠RVG+HE判断造模成功（详见结果2.1），将剩余36只大鼠随机分为空白对照组（K组），氢氧化钙组（Q组）及0.1%纳米银溶液组（N组），每组12只。其中K组对根管行疏通、预备、冲洗，隔湿干燥后，置入PBS棉球;Q组置入氢氧化钙糊剂;N组置入0.1%的纳米银溶液棉球。进口玻璃离子充填暂封窝洞，调整咬合及高点。于用药后7、14、21 d各组随机处死4只大鼠，免疫组织化学检测Foxp3表达，实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction， qRT-PCR）检测RORγT、IL-17的表达。

1.3 组织学检查（HE+免疫组织化学）：用药7、14、21 d后，大鼠左侧下颌骨去尽牙龈等软组织，4%多聚甲醛溶液固定48 h，EDTA脱钙液脱钙30 d，乙醇梯度脱水后浸蜡包埋。沿磨牙长轴近远中向连续切片4 μm，苏木素伊红（HE）染色。切片行胃蛋白酶抗原修复，山羊血清封闭，滴加一抗，以PBS代替一抗作为空白对照，4℃孵育过夜。次日按试剂盒说明书行免疫组化染色，显微镜下观察Foxp3表达并采图。用ImagePro Plus 6.0软件半定量分析Foxp3表达并计算平均光密度值。

1.4 qRT-PCR

1.4.1 RNA提取：取用药7、14、21 d后大鼠右侧下颌第一磨牙根尖周骨组织样品，液氮研磨、Trizol法提取并纯化组织的RNA，选取OD260/OD280比值在1.8～2.0的标本放于-80°冰箱保存或立即PCR。

1.4.2 qRT-PCR反应：采用二步法将RNA反转录为对应的cDNA模板，根据PCR试剂盒于PCR仪行扩增反应，反应体系为20 ul：上下游引物各1.4 ul，模板cDNA 2.0 ul。反应条件：95℃、2 min;95℃、5 s;59℃、30 s，循环40次。每组样本设3个复孔，GAPDH为内参基因，通过2-△△Ct法分析基因的相对表达水平。引物序列见表1。

1.5 统计学分析：采用SPSS 25.0统计软件进行统计学分析，计量资料采用x¯±s表示，多组比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 大鼠慢性根尖周炎模型的建立（RVG+HE）：如图1A箭头处所示，术后2周，RVG结果可见随机抽取的大鼠根尖部有明显的低密度暗影;如图1B箭头处所示，HE染色结果显示，牙髓坏死，根尖区病灶可见淋巴细胞浸润。

2.2 组织学变化：K组于未用药14 d时Foxp3表达随着炎症的进展开始缓慢升高，差异有统计学意义（P<0.05）;Q组用药7、14、21 d时，Foxp3表达逐渐升高，组内对比差异有统计学意义（P<0.05）;N组用药14、21 d时，Foxp3表达高于K组，差异有统计学意义（P<0.05），用药14、21 d时N与Q组对比，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2～3。

2.3 qRT-PCR结果：用药7、14、21 d，N、Q组IL-17表达较K组均下降，差异有统计学意义（P<0.05），但N组较Q组IL-17表达，差异无统计学意义（P>0.05）。用药7 d，N、Q组RORγT表达较K组下降无统计学意义，N组较Q组RORγT表达，差异无统计学意义（P>0.05）。用药14 d，N、Q组RORγT表达较K组下降，差异有统计学意义（P<0.05），N组较Q组RORγT表达，差异无统计学意义（P>0.05）。用药21 d，N、Q组RORγT表达较K组下降，差异具有统计学意义（P<0.05），N组较Q组RORγT表达，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表2～3。

3  讨论

Th17细胞以分泌IL-17为特征，需要RORγT参与启动其增殖及分化过程，具有促炎作用[4]。目前，在人和大鼠慢性根尖周炎病变组织中已检测到IL-17表达[5]。RORγT在健康根尖周组织中几乎不表达，在根尖周病变组织中其表达量显著升高[6]。此外，在被敲除RORγT基因的小鼠体内发现Th17细胞及IL-17的表达较正常小鼠显著减少。研究认为，一定程度上RORγT的含量可大致代表Th17细胞含量。

Treg细胞具有免疫抑制功能，以表达Foxp3为特点，分泌IL-10、TGF-β等抗炎因子，维持机体内环境稳态，控制免疫介导的组织损害[7]。有文献报道，Treg参与调节慢性根尖周炎进程，发挥抑炎及促炎双向调节作用[8]。Foxp3在根尖周病慢性期表达增高，提示Foxp3可抑制过度活化的T细胞，保护机体免受过度炎症反应造成的组织损伤[9]。Th17和Treg细胞正常状态下二者保持相对稳定，当慢性根尖周炎发生时，将诱导Th17分泌增加，导致Th17/Treg比例失衡，加速慢性根尖周炎进展[10]。因此，对大鼠根尖周组织中IL-17、RORγT及Foxp3水平的检测，可大致反映Th17和Treg的表达变化，为临床治疗提供依据。

另有研究发现纳米银渗透作用及生物安全性好，易去除，已应用于各种领域。纳米银的抑菌效果和相对细胞毒性与其浓度呈正相关[11-12];浓度低于25 g/L的纳米银颗粒无细胞毒性。加入纳米银的新型根管封闭剂可再生牙本质矿物质，增加牙本质硬度[13];纳米颗粒抗菌剂因能破坏生物膜并防止细菌粘附，已被提出作为治疗根管内感染的替代方案[14]。当前，也有研究显示，0.1%纳米银溶液的应用对根尖周组织无刺激性[15]，较为安全。

qRT-PCR结果示N、Q组在14、21 d时IL-17、RORγT表达较K组均下调，21 d时，N较Q组IL-17表达无统计学意义，RORγT表达有差异。免疫组化结果示K组随慢性期延长Foxp3表达增高，但未有效终止炎症。N、Q组Foxp3表达较K组上升，且21 d较7 d增加有显著性差异，提示Treg分泌的抑炎因子数量及效能的增加，可减轻根尖周组织病损。以上结果表明纳米银的应用可抑制炎症因子表达，并促进Foxp3分泌，使Th17/Treg免疫平衡恢复正常，促进根尖周组织恢复，进一步验证了Th17/Treg免疫平衡的机制。

綜上所述，0.1%纳米银溶液能有效控制根尖周组织炎症，可降低IL-17、RORγT表达，提高Foxp3水平，这为探寻新的根管消毒药物提供了新的研究思路。本研究不足之处在于仅探讨了封药7、14、21 d时0.1%纳米银溶液的效果，其长远疗效及纳米银最佳抑菌效果在后续细胞或动物实验中需建立时间或药物浓度梯度以进一步研究。

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[收稿日期]2021-09-14

本文引用格式：孙新新，迪丽努尔·阿卜拉，刘涛，等.0.1%纳米银溶液对慢性根尖周炎大鼠RORγT、IL-17及Foxp3表达的影响[J].中国美容医学，2021，31（3）：87-90.