益气解毒复方对Ⅰ、Ⅱ型重症肌无力患者的临床疗效及免疫调节作用＊

杨 娅，刘建辉，李 艳，唐桂华，赵芝兰，余吉林，谭铁城

（1.毕节市中医院 毕节 551700；2.贵州中医药大学第二附属医院 贵阳 550003）

重症肌无力（Myasthenia gravis，MG）是一种主要由乙酰胆碱受体抗体（acetylcholine receptor autoantibody，AChR-Ab）所介导的自身免疫疾病，表现为波动性的骨骼肌无力，一般累及眼外肌、四肢躯干肌及延髓肌，严重者可累及呼吸肌导致呼吸衰竭[1]。国外最新研究[2]表明胸腺生发中心（germinal center，GC）免疫紊乱是MG 发病的关键。GC 内存在两类CD4+T 淋巴细胞亚群：滤泡辅助性T 细胞（T follicular helper cells，Tfh）和滤泡调节性T 细胞（T follicular regulatory cells，Tfr）。Tfh细胞可辅助B 细胞分化为浆细胞和记忆性B 细胞，产生高亲和力抗体，但过度的Tfh 反应可导致自身免疫疾病的发生；Tfr 细胞可抑制Tfh 和B 细胞过度免疫反应、维持免疫耐受，防止自身免疫疾病的发生[3]。Zhang CJ等[4]人通过临床研究发现在MG 患者中Tfr 细胞比例相对减少、Tfh 细胞比例相对增多，验证了Tfr 和Tfh 比例失衡与MG 的发病密切相关。且Tfh 细胞促进B 细胞产生AChR-Ab 是IL-21信号依赖性的，MG患者IL-21水平高于健康对照组[5]，提示IL-21 在Tfh 细胞Th-B 细胞活性中起重要作用。目前MG 的治疗主要包括胆碱酯酶抑制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂、免疫球蛋白、血浆置换、胸腺切除及生物靶向药物[6]。虽然MG 的治疗手段较多，但由于药物副作用及治疗费用等诸多因素，仍有部分患者不能从中获益，严重影响患者的生活及生存质量。Chen S等[7]人通过大量数据分析表明在常规西药的基础上联合中药治疗MG 可协同增效，可减少西药副作用[8]，其机制与重建Treg细胞功能、调节MG免疫耐受有关。

况时祥教授通过总结前人理论基础、长期临床观察，认为MG 可在脾肾亏虚的基础上合并湿邪，其病机多为脾肾阳虚、湿毒内蕴[9-10]；提出补脾益肾、扶阳益损、解毒散结的治疗原则，并创立益气解毒复方（原补脾强力复方）治疗MG[11]。益气解毒复方由黄芪、生地黄、紫河车、人参、仙灵脾、制附子、土茯苓等组成，具有补脾益肾、解毒散结之功。前期研究发现，该方能明显降低实验性自身免疫性重症肌无力（Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis，EAMG）大鼠血清及胸腺CXCL13、IL-21 水平，改善大鼠肌无力症状[12]。该方能否调节MG 患者循环Tfr 与Tfh 比例失衡及IL-21水平尚不清楚。本研究观察益气解毒复方治疗MG 的疗效及对MG 患者血清Tfr、Tfh 细胞比例及IL-21、AChR-Ab的影响，初步揭示益气解毒复方对重症肌无力的免疫调节机制。

1 资料和方法

1.1 一般资料

收集2018 年2 月至2019 年10 月期间于贵州中医药大学第二附属医院神经内科门诊及住院部就诊的患者，采用随机数字表随机分为两组：益气解毒复方组和对照组，每组各30例。本研究经贵州中医药大学第二附属医院伦理委员会批准（批号：PY2019024），所有患者均同意参加该研究并签署知情同意书。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准

采用2015 年中国重症肌无力诊断和治疗指南的诊断标准[13]：①临床特征：某些特定的横纹肌群肌力表现为出现波动性和易疲劳性，肌无力症状晨轻暮重。②药理学特征：新斯的明试验阳性。③电生理学特征：低频重复电刺激检查发现波幅递减10%以上；单纤维肌电图“颤抖”增宽；④血清学特征：可检测到乙酰胆碱受体抗体或抗肌肉特异性激酶抗体。在①的基础上，具②和或③条件，临床上则可诊断为MG。

采用改良Osserman 分型标准[13]。I 型：眼肌型，病变仅局限于眼外肌，2 年之内其他肌群不受累；IIa 型：轻度全身型，四肢肌群轻度受累，通常无咀嚼、吞咽和构音障碍，生活可自理；IIb 型：中度全身型，四肢肌群中度受累，通常有咀嚼、吞咽和构音困难，生活自理困难；III型：重度激进型，起病急、进展快，累及咽喉肌及呼吸肌；IV 型：迟发重度型，隐袭起病，2 年内逐渐发展；V型：肌萎缩型，患者起病半年内即出现肌萎缩。

1.3 纳入标准

①符合西医诊断标准；②符合Osserman 分型标准I 型、II 型者；③18 岁以上；④本人同意参与该研究，并签署知情同意书。

1.4 排除标准

①胸腺瘤患者或曾行胸腺切除、放疗及化疗后患者；②近1月予人免疫球蛋白和血浆置换治疗的患者，近3月予激素、免疫抑制剂治疗的患者；③合并严重内科疾病、自身免疫疾病及精神病患者；④妊娠或哺乳期患者。

1.5 治疗方法

对照组：溴吡斯的明片（上海中西三维药业有限公司，国药准字H31020867）60 mg/次，3-4 次/日，症状好转后可逐渐减量至停药。单纯眼肌型MG 患者口服胆碱酯抑制剂效果不明显者，加用甲泼尼龙片（Pfizer Italia Srl，国药准字H20110064）口服，甲泼尼龙使用方法参照2015 版中国重症肌无力诊断和治疗指南[13]，甲泼尼龙片（激素换算方法：5 mg醋酸泼尼松=4 mg 甲泼尼龙）0.4-0.8 mg/kg/天，晨起顿服，如病情稳定并趋好转，可维持4-16 周后逐渐减量，通常每2-4 周减4-8 mg，至16 mg左右后每4-8周减4 mg，酌情隔日服用最低有效剂量，若减量过程中出现病情加重，则恢复开始剂量冲击，待病情缓解后同上述递减；轻度全身型在口服胆碱酯抑制剂基础上加用中等剂量激素治疗，开始以注射用甲泼尼龙琥珀酸钠（注射用甲泼尼龙琥珀酸钠（40 mg/瓶，Pfizer Manufacturing Belgium NV，国药准字号：H20130301）120-80 mg/天静脉注射3-5天，然后减量至80-60 mg/天,后改为口服，口服方法同上；中度全身型及以上或顽固性眼肌型，在口服胆碱酯抑制剂基础上加用短程大剂量激素冲击治疗，用法如下：甲泼尼龙琥珀酸钠（500 mg/瓶，Pfizer Manufacturing Belgium NV，国药准字号：H20130303）500-1000 mg/天静脉注射3-5 天，然后依次减量为500 mg/天（使用1000 mg 冲击者）、250 mg/天、120 mg/天分别静脉注射3-5天，再改为口服，口服方法同上。使用糖皮质激素期间，常规口服补钙、补钾药物预防电解质紊乱，泮托拉唑等预防激素副作用，疗程为12 周。益气解毒复方组：在对照组基础上加用益气解毒复方（黄芪75 g、人参15 g、制附片20 g、仙灵脾20 g、土茯苓30 g、漏芦9 g、生地黄25 g、紫河车12 g、白芥子9 g 等组成），在此基础上，根据患者辨证情况及病证变化进行临证加减。伴见肝肾阴虚加知母、枸杞、熟地等；夹瘀者加桃仁、红花、川芎等。贵州中医药大学第二附属医院自动化煎药房统一煎药，每日1 剂，水煎成300 mL，分3次温服，疗程为12周。

1.6 观察指标

1.6.1 临床疗效

治疗前后行QMG评分为绝对评分，根据许贤豪相对计分法以QMG 治疗前后绝对评分计算QMG 相对评分，评估治疗后各组临床疗效。QMG 临床相对评分=（治疗前临床绝对记分总分-治疗后临床绝对记分总分）/治疗前临床绝对记分总分[14]。

1.6.2 流式细胞术（FCM）检测血清Tfr、Tfh 细胞比例

分别于治疗前和治疗后抽取肘静脉血检测。主要 试 剂 人FoxP3 PE、CXCR5（CD185）PerCP-Cy5.5、CD4 FITC、Hu CD279 APC 抗体均购于美国BD 公司。按说明书配制红细胞裂解液，FOXP3 固定破膜剂与FOXP3 固定破膜剂洗涤液；流式管内加入新鲜抗凝血与红细胞裂解液，离心、弃上清，制备外周单个核细胞；流式管中分别加入CXCR5、CD4、CD279 进行细胞表面标记染色；加入固定破膜剂破膜，破膜后加入FOXP3 进行细胞内染色；染色后加固定破膜剂洗涤液洗涤，上机检测。

中国真正意义上的瓷器，产生于东汉（公元25—220年），是先辈在长期制陶过程中，不断认识原材料的性能，总结烧制技术，不断改革创新的结果。由于瓷是陶升华的产品，所以陶器的装饰理念也被瓷继承下来，当然瓷器的装饰形式是与时俱进的。

1.6.3 酶免疫吸附法（ELISA）检测血清AChR-Ab、IL-21水平

AChR-Ab、IL-21 试剂盒分别购于abbexa 公司、eBioscience 公司，参照ELISA 试剂盒说明分别于治疗前和治疗后抽取肘静脉血进行检测。

1.6.4 安全性观察

记录患者服药后不良反应，包括皮疹、恶心、腹痛、便秘、腹泻、鼻血等，治疗前后常规行心电图检查及抽血查血常规、尿常规、大便常规+隐血及肝功能、肾功能、电解质。

1.6.5 统计学处理

2 结果

2.1 一般情况

本研究共收集到MG 患者共计60 例。其中，益气解毒复方组男性10例，女性20例，年龄20-60岁，平均年龄36.67±11.70岁，病程0.5-300月，平均病程52.76±67.64 月，胸腺增生4 例，胸腺正常26 例，MG I 型11 人（36.7%），Ⅱa 型7 人（23.3%），IIb 型12 人（40%），QMG评分8.97±5.51 分；对照组男性14 例，女性16 例，年龄20-58 岁，平均年龄39.70±10.53 岁，病程0.2-243 月，平均病程57.44±67.60 月，胸腺增生3 例，胸腺正常27例，MG I 型8 人（26.7%），Ⅱa 型5 人（16.7%），IIb 型17人（56.7%），QMG 评分12.27±7.23 分。两组患者在性别、年龄、病程、Osserman 分型、QMG 评分上均无统计学差异（P＞0.05）。治疗过程中因病情加重加用其他免疫抑制共2 例，益气解毒复方组和对照组各1 例；益气解毒复方组未规律坚持服用中药剔除1 例、随访脱落1 例。最后完成试验56例，其中益气解毒复方组27人，对照组29人。

2.2 治疗前后QMG评分变化

治疗前两组QMG 评分上无统计学差异（P＞0.05）。与治疗前相比，治疗后两组患者QMG评分均明显降低（P＜0.01）；与对照组相比，益气解毒复方组QMG 评分降低更明显（P＜0.01）。QMG评分评估MG患者病情严重程度，试验结果显示治疗后益气解毒复方组QMG评分下降较对照组下降明显，说明益气解毒复方能有效改善MG症状（表1）。

表1 治疗前后QMG评分变化情况

2.3 治疗前后血清Tfr、Tfh细胞比例变化

治疗前两组血清Tfr、Tfh 细胞比例无统计学差异（P＞0.05）。与治疗前相比，治疗后两组患者血清Tfr比

2.4 治疗前后血清Tfr/Tfh比值变化

治疗前两组血清Tfr/Tfh 细胞比例无统计学差异（P＞0.05）。与治疗前相比，治疗后两组患者血清Tfr/Tfh 比值均明显升高（P＜0.01），与对照组相比，益气解毒复方组Tfr/Tfh 比值升高更明显（P＜0.01）。试验结果显示治疗后益气解毒复方组Tfr/Tfh 比值升高较对照组明显，说明益气解毒复方可能通过调节Tfr/Tfh 比值改善MG症状（表3）。

表3 两组治疗前后血清Tfr/Tfh比值变化

2.5 治疗前后血清AChR-Ab水平变化

治疗前两组AChR-Ab 水平无统计学差异（P＞0.05）。与治疗前比较，治疗后两组患者血清AchR-Ab水平均明显下降（P＜0.01），与对照组相比，益气解毒复方组AchR-Ab 水平下降更明显（P＜0.05）。试验结例均明显升高（P＜0.01），Tfh 比例均明显降低（P＜0.01），与对照组相比，益气解毒复方组Tfr比例升高更明显（P＜0.05），Tfh比例下降更明显（P＜0.05）。试验结果显示治疗后益气解毒复方组Tfr 比例升高、Tfh 比例下降较对照组明显，说明益气解毒复方能上调Tfr 细胞比例，下调Tfh细胞比例，可能通过调节Tfr、Tfh细胞比例改善MG症状（表2）。果显示治疗后益气解毒复方组AchR-Ab 水平下降较对照组明显，说明益气解毒复方可能通过下调AchRAb水平改善MG症状（表4）。

表2 两组患者治疗前后血清Tfh、Tfr细胞比例变化

表4 两组患者治疗前后血清AchR-Ab水平变化

2.6 治疗前后血清IL-21水平变化

治疗前两组IL-21 水平无统计学差异（P＞0.05）。与治疗前比较，治疗后两组患者血清IL-21 水平均明显下降（P＜0.01），与对照组相比，益气解毒复方组IL-21 水平下降更明显（P＜0.01）。试验结果显示治疗后益气解毒复方组IL-21 水平下降较对照组明显，说明益气解毒复方可能通过下调IL-21 水平改善MG 症状（表5）。

表5 两组患者治疗前后血清IL-21水平变化

2.7 临床疗效比较

根据贤豪相对计分法评估治疗后两组临床疗效，益气解毒复方组愈显率、有效率明显高于对照组（P＜0.05）。试验结果显示益气解毒复方组有效率、愈显率较前对照组升高，说明益气解毒复方对MG 治疗有较好的临床疗效（表6）。

表6 两组临床疗效比较（%）

2.8 不良反应发生情况

治疗过程中，对照组与益气解毒复组均未见皮疹、恶心、腹痛、便秘、腹泻、鼻血等不良反应，两组心电图、血常规、尿常规、大便常规+隐血及肝功能、肾功能、电解质等均未见明显异常。

3 讨论

近年来，Tfh、Tfr 与重症肌无力的关系逐渐受到重视。研究发现与健康对照者相比，MG 患者外周血Tfh细胞或Tfh样细胞比例明显升高，Tfr细胞或Tfr样细胞比例明显降低[15-17]，Tfr/Tfh比值明显降低[15,17]，经糖皮质激素或他克莫司治疗后，Tfh细胞比例明显降低、Tfr细胞比例及Tfr/Tfh 比值明显升高，MG 症状得到改善[15,17]。因此，调节Tfr/Tfh 比例失衡可能是治疗MG的新途径。本组资料显示，治疗12 周后，与治疗前相比，益气解毒复方组和对照组外周血Tfh 细胞比例明显降低（P＜0.01），Tfr 细胞比例、Tfr/Tfh 比值明显升高（P＜0.01），但与对照组相比，益气解毒复方组在降低Tfh 细胞比例及升高Tfr 细胞比例上更明显（P＜0.05），在升高Tfr/Tfh 比值上尤为明显（P＜0.01）。这说明，在常规西医基础上，联合益气解毒复方可更有效升高Tfr比例、降低Tfh 比例、上调Tfr/Tfh 比值。IL-21 是由多种免疫细胞分泌的细胞因子，在T-B 细胞的相互作用中可能特别重要，并在B 细胞合成特异性IgG 抗体中发挥关键作用。IL-21 在MG 发病中起重要作用。Hu B 等[18]发现，与健康对照组相比，MG 患者外周血IL-21水平明显升高，在抗AChR-Ab 阳性的MG 组中，IL-21的血清浓度与抗AChR-IgG呈正相关。Li Y等[19]发现，与对照组相比，糖皮质激素治疗可明显降低血清IL-21 和AChR-IgG 水平。因此，IL-21 水平与MG 发病密切相关，降低IL-21水平可改善MG症状。本研究显示MG患者经治疗12周后，益气解毒复方组和对照组IL-21和AchR-Ab水平均有下降（P＜0.01），但益气解毒复方组在降低IL-21 及AchR-Ab 上更明显（分别为P＜0.01 和P＜0.05）。说明益气解毒复方可通过降低IL-21 水平而下调AchR-Ab 起作用。益气解毒复方降低IL-21 可能通过Tfh 起作用。IL-21 主要由Tfh 分泌，Tfh 细胞表面高表达ICOS，而B 细胞表面表达ICOS 配体，ICOS 与其配体相互作用，能促进IL-21 的释放，而IL-21 能促进B 细胞分化为浆细胞，促进抗体的分泌和各类Ig 抗体类别的转化而致病[20]。但也有研究认为，IL-21 对Tfh 的分化至关重要[21]。因此，IL-21 和Tfh 的关系及益气解毒复方的具体干预机制还有待进一步研究。

MG 属中医“痿病”、“睑废”等范畴，目前多数学者认为MG 的中医病机多认为和脾肾相关，并以补脾益肾治疗MG，取得较好效果[22-24]。我们前期临床观察发现，MG 患者舌质多淡胖，苔多厚腻，合并湿毒之邪[9]。张永德等[25]总结近十年文献，认为MG 以脾、肾最为关键，正气亏虚是重症肌无力发生的前提，湿浊、瘀、毒是反复不愈、肌肉痿废不用的病理基础。因此，MG 中医病机多以脾肾亏虚为本，脾肾亏虚日久，可导致水湿运化无权，再伤脾肾，而成痼疾。况时祥教授以补脾益肾、化湿解毒治疗MG，取得较好临床疗效[11]。益气解毒复方重用黄芪为君药，配合人参益气健脾，以制附子、仙灵脾温补肾阳，佐以土茯苓、漏芦化湿、解毒、泄浊，全方健脾益肾、化湿解毒，正扣MG 脾肾亏虚、湿毒内蕴的病机特点。MG的中医病机与MG的西医分型有一定相关性，I型以脾气虚弱多见，IIa型脾肾亏虚渐多，Ⅱb 型以脾肾亏虚多见[26]。本研究入组患者无论是益气解毒复方组还是对照组，Ⅱ型患者所占比例均较高，分别为63.3%和73.4%，以益气解毒复方治疗切合MG 脾肾亏虚的中医病机特点，加用化湿解毒一可防治MG 患者内生之湿邪，二可防止湿邪内损脾肾而反复不愈。研究结果显示，治疗12 周后，益气解毒复方组能明显改善Ⅰ、Ⅱ型MG 患者QMG 评分（P＜0.01），其有效率、愈显率明显优于对照组（P＜0.05）。说明在常规西药的基础上，联合益气解毒复方可起到协同增效作用，能在短期内改善Ⅰ、Ⅱ型MG 患者的QMG评分，提高MG的近期疗效。

综上所述，在常规西医治疗的基础上，联合益气解毒复方治疗MG 近期疗效明显，有协同增效作用，其机制可能与升高血清Tfr 细胞比例、降低血清Tfh 细胞比例，上调Tfr/Tfh 比值及减少IL-21，从而降低AchRAb水平有关。但由于研究条件及时间限制，本研究样本量偏小，未观察该方对Ⅲ型及以上MG 的疗效，另外，该方对MG的长期疗效及对MG复发的的影响尚不清楚，因此，该方对其它Osserman分型MG的临床疗效及该方的远期疗效还有待进一步研究。