基于网络药理学及分子对接技术探讨利胆化痰活血方治疗代谢综合征的分子机制＊

张 强，阮 君，尚浩南，刘凯利，肖铁刚，王 兵＊＊

（1.上海交通大学附属第六人民医院 上海 200233；2.上海中医药大学附属上海市中西医结合医院 上海 200082）

代谢综合征是以肥胖、糖耐量异常、脂代谢异常、高血压以及高尿酸血症等聚集发病、影响机体健康的一组症候群，是全身性、多系统的疾病[1]。代谢综合征的发病机制尚不明确，但国际上广泛认为其与遗传因素，中心性肥胖，脂代谢异常，内皮功能障碍，慢性低度炎症，肠道菌群紊乱等相关[2-4]。最近的研究认为，胆汁酸稳态的失调造成对糖代谢，脂质代谢，能量代谢调控的紊乱，在代谢综合征发病中起到重要作用[5]，因此针对代谢性疾病的新药研究就聚焦于调节胆汁酸的稳态[6-7]，这与中医学对代谢综合征少阳枢机不利为发病之本，痰瘀为重要病理基础的认识相一致。中医学认为，代谢综合征可归于“脾瘅”“消渴”“脘痞”“湿阻”“肥满”等病证范畴[8]，病位在于脾、肝、肾三脏[9]，脏腑气血阴阳虚损，产生痰、瘀、热、湿等病理产物[10]，痰湿和瘀血既是病理产物，又是致病因素，进一步阻碍气血津液的运行，最终导致代谢综合征的发生。

利胆化痰活血方是王兵教授基于对代谢综合征少阳枢机不利为发病之本，痰瘀为重要病理基础的认识，创制的治疗代谢综合征的复方。利胆化痰活血方由玉米须30 g、虎杖15 g、陈皮9 g、制半夏6 g 和丹参15 g 组成。玉米须具有清肝利胆，利尿消肿作用。玉米须有效成分在减轻体质量、降压、降糖和降脂中具有广泛的药理活性，对于代谢综合征组分疾病具有良好的防治作用，已广泛应用于代谢综合征的临床治疗，且无明显副作用[11-12]。虎杖利湿退黄，清热解毒，散瘀止痛，止咳化痰，在降血脂，抗动脉粥样硬化，抑制血小板聚集、抗血栓、降血糖方面疗效颇佳[13]。半夏燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结；陈皮理气健脾，燥湿化痰。半夏和陈皮作为化痰法的代表药物和大量化痰复方的核心组成，在化痰祛湿中应用广泛。丹参活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈，可改善微循环、减轻血液黏稠度，具有扩张血管、降脂、降压及降糖作用[14]。5 味中药配伍使用，共奏清热利胆，化痰活血功效。

代谢综合征的发生发展涉及多因素的影响，难以通过影响单一靶点产生良好的治疗效果，因而许多代谢综合征患者会寻求中医治疗。但传统中医药治疗代谢综合征的机制尚不清楚。并且代谢综合征发病机制复杂，单一的理论难以解释其发病机制，而网络药理学“中药组分－靶点－通路”这一相互作用网络出发，其系统性对解释中医药在代谢综合征中的治疗机制可能有益。本研究受到上海市中医药传承和科技创新项目（ZYKC2019035），上海市综合医院中西医结合专项（ZHYY-ZXYJHZX-201910），国家自然科学基金青年科学基金项目（81704006）的支持，基于此项目的支持，本课题组建立了代谢综合征患者健康管理平台，明确了基于“少阳枢机不利”理论组方的中药复方对代谢综合征患者的改善作用。但利胆化痰活血方对代谢综合征的作用机制尚不明确。本研究从网络数据库中分别获取了利胆化痰活血方和代谢综合征的作用靶点。通过蛋白质相互作用（Protein-protein interaction，PPI）分析，基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）综合评价利胆化痰活血方治疗代谢综合征的有效成分，核心作用靶点及通路。最后用分子对接技术及实验验证其潜在结合活性。即探讨利胆化痰活血方治疗代谢综合征的药效物质基础及潜在效应机制。

1 材料与方法

1.1 利胆化痰活血方有效成分与作用靶点的获取

利用中药系统药理学分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）[15]分别检索利胆化痰活血方中各个组分，以口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥18%，半衰期（HL）≥4，Caco-2≥0.2为标准筛选潜在有效成分[16]。在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中获取有效成分的2D 结构并保存为sdf 格式，随后将其导入SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch）[17]中预测其潜在作用靶点。

1.2 代谢综合征疾病靶点的获取

在DisGeNET 数据库（https://www.disgenet.org）[18]中，以“Metabolic syndrome”为检索词条，对代谢综合征相关基因进行检索和收集，获得代谢综合征相关基因靶点，随后利用R×64 3.6.1 软件进行韦恩分析寻求利胆化痰活血方有效成分与代谢综合征交集作用靶点。

1.3 利胆化痰活血方有效成分与代谢综合征GO功能分析与KEGG通路富集分析

使用clusterProfiler 软件包[19]分别对利胆化痰活血方有效成分与代谢综合征作用靶点进行GO 功能分析，对其交集靶点作KEGG 通路分析。探讨利胆化痰活血方组分与代谢综合征作用靶点的基因生物功能，以及交集靶点在相关信号通路中的调控作用。

1.4 PPI 网络和有效成分-核心靶点关联网络的构建

将交集靶点输入STRING11.0 数据库（http://string-db.org）中，选取置信度≥0.4 的区间，将输出的文本数据导入Cytoscape3.7.2软件中，建立利胆化痰活血方组分与代谢综合征交集靶点的PPI网络。进行网络分析得出PPI 网络中核心靶点，结合有效成分的作用靶点匹配得到利胆化痰活血方调控核心靶点的有效成分。借助Cytoscape3.7.2 软件构建利胆化痰活血方有效成分-核心靶点关联网络。

1.5 分子对接验证有效成分与核心靶点结合活性

从TCMSP 数据库中下载有效成分的mol2 结构，利用pymol 软件将其转换为pdb 格式，导入AutoDockTool1.5.6软件中进行加氢，计算电荷等处理，导出为pdbqt 格式。从PDB 数据库（https://www1.rcsb.org/）中获得核心靶点蛋白的pdb 格式文件，导入AutoDockTool1.5.6软件中进行加氢，计算电荷等处理，导出为pdbqt 格式。以蛋白与原配体结合的活性口袋坐标为活性中心，在AutoDock Vina软件中进行半柔性对接，寻找配体与蛋白质氨基酸残基之间的相互作用，结合能越低表明其对接活性越好。

1.6 动物实验验证

雄性SD 大鼠18 只，体质量150±20 g，6-8 周龄，SPF级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2012-001。适应性饲养1 周，随机分为空白组（C，n=6）和模型组（M，n=6），利胆化痰活血方组（H，n=6），C 组予普通饲料喂养，M 组与H 组予高脂高糖高盐饲料喂养，共12 周。13 周起，C 组和M 组予生理盐水灌胃，H 组以5 mL·kg-1的利胆化痰活血方汤剂灌胃6 周。18 周末，禁食不禁水12 h，处死大鼠，取肝脏于-80℃保存待用。

取出大鼠的肝脏样本，称取50 mg 肝组织，加入1 mL Trizol。经匀浆，分离，沉淀，洗脱，再溶解得到总RNA 并测定其纯度，将总RNA 逆转录为cDNA 模板产物。取SYBR10 μL、上下游引物各1 μL（引物列表见表1）、cDNA 2 μL 混合成为20 μL 反应体系。反应程序设定为：95℃，10 min，预变性，扩增循环后，95℃，15 s，随后60℃，1 min，共40 循环。最后以2-ΔΔCT 的方式相对定量分析。

表1 PCR引物的序列

2 结果

2.1 利胆化痰活血方有效成分的筛选

检索利胆化痰活血方的所有成分，共取得540 个成分，包括玉米须97 个，虎杖62 个，半夏116 个，陈皮63 个，丹参202 个。根据OB，DL，HL，Caco-2 的界定值和去重处理，在TCMSP 数据库中共获取66 个活性化合物作为其有效成分，包括玉米须9 个，虎杖4 个，半夏9 个，陈皮5 个。利用SwissTargetPrediction 预测并去重后得到273个利胆化痰活血方作用靶点。

2.2 利胆化痰活血方有效成分与代谢综合征交集靶点的韦恩分析

从DisGeNET 数据库中获得的1125个代谢综合征作用靶点，与273个利胆化痰活血方作用靶点取交集，得到95个交集靶点（图1）。

2.3 利胆化痰活血方有效成分靶点与代谢综合征作用靶点的GO功能分析

利用clusterProfiler分别对利胆化痰活血方有效成分靶点与代谢综合征作用靶点进行GO 功能分析。GO 功能分析分为生物过程（Biological process，BP），细胞组件（Cellular component，CC），分子功能（Molecular function，MF）三部分，每部分根据p.adjust 值大小取top8 建立条形图（图2、图3）。GO 富集分析显示，利胆化痰活血方和代谢综合征可以同时影响类固醇结合，一元羧酸结合，核受体活性，转录因子活性，直接的配体调节序列特异性DNA结合。

图2 利胆化痰活血方靶点GO功能分析条形图

图3 代谢综合征有效成分及靶点GO功能分析条形图

2.4 利胆化痰活血方有效成分与代谢综合征交集靶点PPI网络的构建

运用STRING数据库和Cytoscape软件共同建立了利胆化痰活血方与代谢综合征交集靶点PPI 网络（图4）。对PPI 网络进行NetworkAnalyzer 分析 后，利用Generate Style from Statistics 工具，以Degree 值为依据，将靶点的面积从大到小，颜色从亮到暗进行排序；以combined-score 为依据，将靶点与靶点联线从粗到细，颜色从亮到暗进行排序。该网络涉及95 个蛋白质节点。拓扑分析表明，该网络中2 倍Degree 值的中位数为26。PPI 网络中Degree 值大于26 的蛋白节点有14个（表2）。这些关键蛋白节点是整个PPI网络的核心，同时是利胆化痰活血方治疗代谢综合征的核心靶点。

图4 利胆化痰活血方有效成分与代谢综合征交集靶点PPI网络

表2 利胆化痰活血方有效成分治疗代谢综合征的核心靶点

利用clusterProfiler对这14个核心靶点进行KEGG通路富集分析。共获得11 条通路，根据p.adjust 值建立气泡图（图5），气泡图取排名前10 的通路。主要涉及包括内分泌抵抗，EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药，HIF-1 信 号通路，FoxO 信号 通 路，Rap1 信号通路，MAPK 信号通路，ErbB 信号通路，鞘脂信号通路，Ras信号通路，趋化因子信号通路。这表明利胆化痰活血方有效成分可以通过调控这些通路治疗代谢综合征。

图5 利胆化痰活血方有效成分与代谢综合征交集靶点KEGG通路富集分析

2.5 利胆化痰活血方有效成分-核心靶点-通路关联网络的构建

从PPI 网络中选取Degree 值大于26 的14 个核心靶点，再与利胆化痰活血方有效成分靶点相匹配，得到38 个靶向核心靶点的有效成分，在Cytoscape3.7.2软件中可视化后，构建利胆化痰活血方有效成分-核心靶点-通路关联网络（图6）。该网络含68 个节点，204 条连线。其中涉及到利胆化痰活血方与核心靶点的连线组合有129 对。在网络图中，玉米须、虎杖、半夏、陈皮、丹参均以圆形，玫瑰红色表示；有效成分以正六边形，红色表示；核心成分以倒三角形，深绿色表示；相关靶点以三角形，浅绿色表示。其中玉米须和陈皮中均含有谷甾醇（Sitosterol），玉米须和半夏中均含有豆甾醇（Stigmasterol），虎杖，半夏中均含有β-谷甾醇（Beta-sitosterol）。

图6 利胆化痰活血方有效成分-核心靶点-通路关联网络

从PDB 数据库中分别获取每个靶点3D 结构，以pdb 格式保存，分别为AKT1（PDBID:6hhf），MAPK3（PDBID:4qtb），VEGFA（PDBID:3bdy），PTGS2（PDBID:5ikt），EGFR（PDBID:5uwd），ESR1（PDBID:1yin），STAT3（PDBID: 6njs），PPARG（PDBID: 2vv2），AR（PDBID:1t73），MAPK14（PDBID:6sfo），NR3C1（PDBID:3k22），MMP9（PDBID:6esm），F2（PDBID:1dwd），PGR（PDBID:3g8o）。以原配体结合的坐标为活性口袋位置，对接参数设置为size_x=16.00，size_y=16.00，size_z=16.00，energy_range=4，exhaustiveness=9，num_modes=9。利用AutoDock Vina 软件分析129 对利胆化痰活血方有效成分与14个核心靶点的组合的潜在结合活性。分子对接结果表明，有效成分与核心靶点结合活性较高的有为MMP9 与金圣草黄素（Chryseriol）（最佳结合能 活 性 为-10.1 kcal·mol-1），MMP9 与 黄 芩 素（Baicalein）（最佳结合能活性为-9.9kcal·mol-1），AKT1与金圣草黄素（最佳结合能活性为-8.8kcal·mol-1），PPARG 与豆甾-7-烯-3-醇（Stigmasta-7-en-3-ol）（最佳结合能活性为-8.5kcal·mol-1）。随后在pymol 中将其可视化（图7）。

图7 分子对接结果示意图

2.6 Real-time PCR 法检测大鼠肝脏中AKT1，PPARG，MMP9的mRNA表达水平

Real-time PCR 法检测分子对接预测的核心基因靶点 的mRNA 结 果 显示：与C 组相 比，M 组AKT1，PPARG 的mRNA 表达水平显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；与M组相比，H组AKT1，PPARG，MMP9 的mRNA 表达水平显著上升，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）（图8）。这表明高脂高糖高盐饮食的造模使得大鼠肝脏中AKT1，PPARG 的mRNA 表达下降，经过利胆化痰活血方的治疗，AKT1，PPARG的mRNA表达水平明显上升。

图8 利胆化痰活血方对代谢综合征大鼠肝脏AKT1，PPARG，MMP9的mRNA表达水平的影响

3 讨论

本研究旨在预测利胆化痰活血方治疗代谢综合征药效物质基础及潜在效应机制。结果共筛选出利胆化痰活血方有效成分66个，包括玉米须9个，虎杖4个，半夏9 个，陈皮5 个。其中谷甾醇同时存在于玉米须和陈皮中，豆甾醇同时存在于玉米须和半夏中，β-谷甾醇同时存在于虎杖和半夏中。利胆化痰活血方有效成分靶点和代谢综合征的作用靶点取交集后共获得95 个交集靶点。这95 个交集靶点为潜在的利胆化痰活血方治疗代谢综合征的靶点。GO 富集分析显示，在生物过程中，利胆化痰活血方主要影响类固醇代谢过程，激素代谢过程，对类固醇激素的反应，对细菌起源分子的反应，对脂多糖的反应，类二十烷酸代谢过程，有机阴离子运输，小分子代谢过程的调控，而代谢综合征主要影响对营养水平的反应，脂质定位，脂质代谢过程的调节，对肽激素的反应，脂质转运，多细胞生物体内平衡，激素转运，激素分泌。由此可见，利胆化痰活血方有效成分与代谢综合征均显示出对脂代谢过程的影响。在细胞组件方面，利胆化痰活血方主要与膜筏，膜微区，膜区，突触前膜的组成部分，突触前膜的固有成分，RNA 聚合酶II 转录因子复合物，神经细胞体ESC/E（Z）络合物相关，代谢综合征与囊泡腔，细胞质囊泡腔，内质网腔，分泌颗粒腔，血浆脂蛋白颗粒，脂蛋白颗粒，蛋白质-脂质复合物，膜筏相关。而膜筏这一细胞组件同时与利胆化痰活血方有效成分和代谢综合征的相关。关于分子功能，利胆化痰活血方主要与核受体活性，转录因子活性，直接的配体调节序列特异性DNA 结合，类固醇激素受体活性，碳酸盐脱水酶活性，类固醇结合，一元羧酸结合，类花生酸受体活性，前列腺素受体活性相关。代谢综合征与受体配体活性，细胞因子受体结合，激素活性，细胞因子活性，类固醇结合，一元羧酸结合，核受体活性，转录因子活性，直接的配体调节序列特异性DNA结合。这表明利胆化痰活血方有效成分和代谢综合征的作用靶点可以同时影响到类固醇结合，一元羧酸结合，核受体活性，转录因子活性，直接的配体调节序列特异性DNA 结合。随后构建了交集靶点PPI 网络，并从中筛选出14 个，核心靶点，分别为AKT1，MAPK3，VEGFA，PTGS2，EGFR，ESR1，STAT3，PPARG，AR，MAPK14，NR3C1，MMP9，F2，PGR。KEGG 通路分析显示其主要与内分泌抵抗相关。结合核心靶点与其对应的利胆化痰活血方有效成分，构建利胆了化痰活血方有效成分-核心靶点-通路关联网络，该网络表明38 个活性成分和14 个靶点组成的129个有效成分与靶点组合可能是其潜在起效组合。分子对接结果预测出的最佳组合包括MMP9与金圣草黄素，MMP9 与黄芩素，AKT1 与金圣草黄素，PPARG 与豆甾-7-烯-3-醇，结合利胆化痰活血方有效成分-核心靶点-通路关联网络可知，黄芩素为半夏中的有效成分，金圣草黄素和豆甾-7-烯-3-醇为玉米须中的有效成分，这一定程度上反映了玉米须在利胆化痰活血方中起到核心作用。

动物实验显示，利胆化痰活血方可能上调了大鼠肝脏AKT1 和PPARG 的mRNA 表达水平，这与大鼠代谢综合征的改善相关。在骨骼肌和肝脏中，糖脂代谢的紊乱会抑制PI3K/AKT 信号通路，导致胰岛素抵抗。反过来胰岛素抵抗也会影响PI3K/AKT 信号通路。调控PI3K/AKT在代谢性疾病的治疗中有一定的潜力[20]。此外，PPARG 为核受体超家族成员。PPARG 主要表达在脂肪，肌肉，神经系统中，激动PPARG与促进游离脂肪酸吸收，脂肪细胞分化，血糖吸收，TG 储存相关，并可改善胰岛素抵抗和游离脂肪酸水平[21]。

结合利胆化痰活血方有效成分-核心靶点-通路关联网络可知，利胆化痰活血方中的活性成分Chryseriol 可能作用于AKT1 改善代谢综合征；利胆化痰活血方中的活性成分Stigmasterol，Beta-sitosterol，10, 13-eicosadienoic， Gondoic acid， Naringenin，Sitosterol， 5, 7-dihydroxy-2- (3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one，Poriferast-5-en-3betaol，Poriferasterol，Stigmasta-7-en-3-ol，Schottenol，stigmasta-4,22-diene-3beta,6beta-diol，(3S,6R,8S,9S,10R, 13R, 14S, 17R) -17- [(1R, 4R) -4-ethyl-1, 5-dimethylhexyl]-10,13-dimethyl-2,3,6,7,8,9,11,12,14,15,16, 17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthrene-3,6-diol，Mandenol 可 能 作 用 于PPARG 改 善 代 谢 综合征。

综上所述，本研究发现治疗代谢综合征的关键成分包括利胆化痰活血方中的Chryseriol，hottenol，stigmasta-4,22-diene-3beta,6beta-diol，(3S,6R,8S,9S,10R, 13R, 14S, 17R) -17- [(1R, 4R) -4-ethyl-1, 5-dimethylhexyl]-10,13-dimethyl-2,3,6,7,8,9,11,12,14,15,16, 17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthrene-3,6-diol，Mandenol。核心靶点可能是AKT1 和PPARG。其作用通路可能与脂代谢过程，类固醇结合，内分泌抵抗相关。

本研究利用网络药理学及分子对接技术，从系统层面对利胆化痰活血方的多成分，多靶点与代谢综合征疾病靶点之间的网络关系进行分析，预测了潜在的利胆化痰活血方有效成分与作用靶点组合，并从分子生物学层面探讨发现AKT1 和PPARG 在利胆化痰活血方改善大鼠代谢综合征中起到重要作用。这些结果为未来利胆化痰活血方及其有效成分的进一步开发及应用提供了重要参考。