萝卜硫素对自身免疫性甲状腺炎小鼠的作用及机制

李智奇，喻涛

（深圳市龙华区人民医院甲乳外科，广东深圳518109）

自身免疫性甲状腺炎（autoimmune thyroiditis,AIT）是一种自身免疫功能紊乱所引起的甲状腺疾病，其临床症状多样，但其主要症状有甲状腺肿、甲状腺功能减退和甲状腺组织纤维化等[1]。而在AIT多种类型中，桥本甲状腺炎（Hashimoto's thyroiditis，HT）最为常见和典型，占甲状腺疾病的22.5%左右[2]。随着人们生活方式的改变以及生活水平的逐步提高，HT 的发病率有不断上升的趋势[3]。虽然研究表明AIT的发病与炎症、免疫、氧化损伤和凋亡等有关[4‑7]，但其具体的发病机制尚未完全阐明。虽然临床上使用的抗AIT药物，如糖皮质激素、左旋甲状腺素、雷公藤多苷片等能获得一定疗效，但存在不良反应多以及断药易复发等缺点[8]，故寻找新的替代药物仍刻不容缓。

萝卜硫素，又称“莱菔硫烷”，是一种异硫氰酸盐，是芥属的十字花科植物所富含的一种由芥子苷水解后所得的水溶性物质，具有抗氧化、抗炎、免疫调节、诱导细胞凋亡等生物学效应[9‑11]。基于目前萝卜硫素对自身免疫性甲状腺炎的实验研究尚未见报道，本实验利用BALB/c 小鼠通过皮下多点注射猪甲状腺球蛋白以及联合高碘水的方法构建小鼠自身免疫性甲状腺炎模型（experimental autoim‑mune thyroiditis,EAT），用于进一步探讨萝卜硫素对EAT的作用及其机制。

1 材料

1.1 实验动物

60只SPF级、雌性BALB/c小鼠，体质量18～22 g，购于广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（粤）2019‑0002。

1.2 药品与试剂

萝卜硫素（厦门旭丽金生物科技有限公司）；猪甲状腺球蛋白（PTg）、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂（Sigma 公司）；碘化钠（NaI，金锦乐化学有限公司）；雷公藤多苷片（10 mg/片，贵州汉方药业有限公司）；小鼠TPOAb 化学发光试剂盒和小鼠TGAb 化学发光试剂盒（上海安妍生物有限公司）；IL‑6、IL‑17和IL‑23 ELISA 检测试剂盒（深圳市科润达生物工程有限公司）；EGFR 和Nrf2 单克隆抗体（Abcam公司）。

1.3 主要仪器

800TS 吸收光酶标仪（美国Biotek 伯腾公司）；IX71 光学显微镜（日本Olympus 公司）；JYD‑325 型轮转切片机（金华市宇典医疗器械厂）；WD‑9413C型凝胶成像分析系统（福州申辉化工仪器设备有限公司）。

2 方法

2.1 EAT模型建立

参照文献[12]等方法构建小鼠EAT 模型，将PTg 与完全弗氏佐剂按体积比1∶1 制成油包水乳剂，制备质量浓度为0.25 mg/mL。按50 μg/只的剂量从动物背部皮下选取多个注射点注射上述自制的乳剂，给药频次为1次/周，给药周期为2周。从第3 周开始注射由不完全弗氏佐剂联合PTg 乳化的油包水乳剂，制备质量浓度为0.25 mg/mL 的清液，给药剂量和频次同上，给药周期为3周，每周的注射部位分别为背部皮下、颈部皮下以及腹腔，每日正常自由饮用高碘水（质量浓度为0.63 mg/mL）。

2.2 分组与给药

实验共分为6 组，分别为空白对照组、模型组、雷公藤多苷片组、萝卜硫素低剂量组、萝卜硫素中剂量组、萝卜硫素高剂量组，每组10只。造模完成后给药，其中雷公藤多苷片组给药剂量为5 mg/（kg·d），萝卜硫素低、中、高剂量组给药剂量分别为5、10、20 mg/（kg·d），给药方式为灌胃给药，其余两组灌胃给予等体积生理盐水，1次/d，共30 d。

2.3 检测指标

实验结束后，10%（φ）水合氯醛腹腔注射麻醉，以摘眼球方式取血，4 ℃冰箱放置2 h，3 000 r/min 4 ℃冰冻离心5 min，分离血清并保存备用。酶联免疫法分别检测血清中TGAb、TPOAb、IL‑6、IL‑17 和IL‑23水平。小心分离小鼠甲状腺组织，10%（φ）中性甲醛溶液浸泡固定左侧甲状腺组织，用于石蜡切片、HE染色，观察甲状腺组织的病理学变化。Western blot 法检测甲状腺组织匀浆中EGFR 和Nrf2 蛋白含量。

2.4 统计学方法

采用SPSS 16.0 软件对实验数据进行统计学分析（单因素方差分析），计量资料以±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 萝卜硫素对各组小鼠甲状腺组织病理学变化的影响

空白对照组小鼠甲状腺组织中腺泡呈立方状，间质厚度正常，无炎症细胞浸润，腺泡腔内的胶质分布均匀（图1A）。模型组小鼠甲状腺结构异常，滤泡间隔变厚，大量炎症细胞浸润（图1B）。相对模型组，雷公藤多苷片组和萝卜硫素给药组以上病理征有不同程度的改善，可见甲状腺滤泡间隔变薄，炎症细胞浸润减轻，其中萝卜硫素高剂量组和雷公藤多苷片组改善效果最好（图1C-F）。

图1 各组小鼠甲状腺组织病理形态学观察（HE染色，200×）Figure 1 Histomorphological observation of thyroid gland in each group of mice

3.2 萝卜硫素对各组小鼠血清TGAb 和TPOAb 水平的影响

与空白对照组比较，模型组小鼠血清TPOAb和TGAb含量明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，雷公藤多苷片组和萝卜硫素给药组小鼠血清TPOAb 和TGAb含量均明显降低（P＜0.01）。与萝卜硫素低剂量组比较，雷公藤多苷片组和萝卜硫素高剂量组小鼠血清TGAb和TPOAb含量明显降低（P＜0.05），见图2。

图2 各组小鼠血清TPOAb和TGAb的水平变化Figure 2 Changes in serum TPOAb and TGAb levels in each group of mice(±s,n=10)

3.3 萝卜硫素对各组小鼠血清IL‑6、IL‑17 和IL‑23水平的影响

与空白对照组比较，模型组小鼠血清IL‑6、IL‑17 和IL‑23 水平均明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，雷公藤多苷片组和萝卜硫素给药组小鼠血清IL‑6、IL‑17 和IL‑23 水平均明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）。与萝卜硫素低剂量组比较，雷公藤多苷片组和萝卜硫素高剂量组小鼠血清IL‑6 和IL‑23 水平明显降低（P＜0.05）。萝卜硫素高剂量组还可降低小鼠血清IL‑17的水平（P＜0.05或P＜0.01），见图3。

图3 各组小鼠血清IL‑6、IL‑17和IL‑23的水平变化Figure 3 Changes of serum IL‑6，IL‑17 and IL‑23 levels in each group of mice(±s,n=10)

3.4 萝卜硫素对各组小鼠甲状腺组织EGFR 和Nrf2 蛋白的表达水平的影响

与空白对照组比较，模型组小鼠甲状腺组织EGFR 蛋白的相对表达量显著升高（P＜0.01），而Nrf2 蛋白的相对表达量显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，雷公藤多苷片组和萝卜硫素给药组小鼠甲状腺组织EGFR 蛋白相对表达量显著降低（P＜0.05 或P＜0.01），而Nrf2 蛋白的相对表达量显著升高（P＜0.01）。与萝卜硫素低剂量组比较，雷公藤多苷片组和萝卜硫素高剂量组小鼠甲状腺组织EGFR蛋白相对表达量显著降低（P＜0.01），而Nrf2 蛋白的相对表达量显著升高（P＜0.05），见图4。

图4 各组小鼠甲状腺组织EGFR和Nrf2 蛋白的表达水平Figure 4 Expression levels of EGFR and Nrf2 proteins in thyroid tissues of various groups of mice(±s,n=10)

4 讨论

自身免疫性甲状腺炎是一种临床上常见的甲状腺疾病，属于特异性自身免疫病范畴。虽然目前用于建立EAT动物模型较多[13]，其中高碘联合Tg的造模方法以造模方法简单以及成功率较高的特点，成为建立EAT 动物模型的理想方法[14‑15]。雷公藤多苷对EAT 的药效早已有研究证实[16]，雷公藤多苷片具有祛风解毒、除湿消肿和舒经通络的作用，用于治疗类风湿性关节炎、肾病综合征和系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病，研究表明其药理作用包括抗炎、免疫调节以及抗氧化损伤等[17]。故本研究选取雷公藤多苷片作为萝卜硫素的阳性对照药，探讨萝卜硫素对小鼠EAT模型的治疗效果。

萝卜硫素具有抗氧化、抗炎及抗癌等多种生物活性[9‑11]。其作用机制涉及激活Nrf2信号通路，上调多种抗氧化蛋白的表达，下调NF‑kB 信号通路蛋白和TNF‑α、TGF‑β等炎症因子的表达[18]。本研究发现模型组甲状腺部分滤泡间质变厚，纤维结缔组织增生，有较多炎症细胞浸润，血清TGAb、TPOAb 含量显著升高，与吴朝文等[12]研究一致，提示EAT 模型建立成功。给予不同剂量的萝卜硫素可不同程度改善上述指标。可见，不同剂量的萝卜硫素可显著改善EAT 的病理学变化和自身抗体的水平，呈现一定的剂量依赖关系。雷公藤多苷片组的作用效果与萝卜硫素高剂量组相似。

近年来，Th17 细胞在AIT 发生发展进程中的作用逐渐引起科研工作者的注意，其中IL‑17 是一种主要由Th17 细胞分泌的细胞因子，也是Th17 细胞发挥效应的最为主要的细胞因子之一，全程介导了AIT 致病过程的炎症反应和免疫损伤[19]。而IL‑23参与了Th17 细胞的增殖和分化调节，是Th17 细胞增殖和分化的重要细胞因子。此外，IL‑17 和IL‑23可形成特殊的炎性轴，激活多条炎症信号通路，促进多种炎症因子的表达，如IL‑6，形成复杂的炎症网络，在多种自身免疫性疾病中发挥极为重要的作用[20]。本研究结果表明不同剂量的萝卜硫素可明显降低血清IL‑6、IL‑17和IL‑23的含量，提示萝卜硫素可能抑制Th17细胞炎症因子的释放，从而减轻EAT的炎症。雷公藤多苷片组的作用效果与萝卜硫素高剂量组相似。

组织表皮生长因子是体内多种激素生长和发育所需的重要物质，如甲状腺素和性激素等，组织表皮生长因子与其受体EGFR结合后活化并传导一系列的细胞内信号，如EGFR 表达异常可引起甲状腺细胞增殖和发育异常[21]。而Nrf2 是体内一种有效的抗氧化损伤的重要转录因子，可保护甲状腺细胞免受机体氧化应激损伤。当甲状腺处于氧化应激条件下，Nrf2 可磷酸化并与Keaol蛋白解离，进入细胞核内与ARE结合，从而启动下游多个抗氧化基因的转录翻译，以此对抗机体的氧化应激反应[22]。不同浓度的萝卜硫素可显著下调甲状腺组织EGFR蛋白表达水平，上调Nrf2 蛋白的表达水平，提示其可从抑制甲状腺细胞异常发育以及抗氧化损伤的层面保护甲状腺细胞。雷公藤多苷片组的作用效果与萝卜硫素高剂量组相似。

本研究结果表明，萝卜硫素可减轻自身免疫性甲状腺炎的炎症水平，下调甲状腺组织EGFR 蛋白表达水平，上调Nrf2 蛋白表达水平，从而改善甲状腺功能，该研究为萝卜硫素在抗AIT 的临床应用提供了部分理论依据。