赤拟谷盗气味结合蛋白研究进展

桑育黎，石 磊，辛跃强，韩甜甜，范广文

(辽宁大学 药学院，辽宁 沈阳 110036)

赤拟谷盗(TriboliumcastunemHerbst)为鞘翅目，拟步甲科，拟谷盗属昆虫，是一种重要的世界性仓储害虫[1]，广泛分布于热带与较温暖地区，在我国至少23个省(区)有分布[2].研究表明，赤拟谷盗对温度要求较高，35℃时卵孵化率最高[3-4].其食性复杂，主要寄生于小麦、玉米、稻谷、高粱、干果、中草药、生药材等.其成虫体表具有臭腺，该腺体可分泌苯醌等致癌物质[5]，会使面粉等商品在储藏过程中出现结块、变色及发臭等现象而不能使用[6].由于其寿命较长，繁殖迅速，食性复杂，适应性强，可对多种商品造成严重损害，导致巨大的经济损失.目前，赤拟谷盗的基因组测序已经完成，已成为第二大模式昆虫[7].

昆虫借助嗅觉系统感知外界环境信息，指导其进行觅食、交配、繁殖及躲避天敌等活动[7].据报道，其外周嗅觉系统包含多种蛋白，如气味受体(Odorant receptors，Ors)[8]、气味结合蛋白(Odorant-binding proteins，OBPs)[9-11]、化学感受蛋白(Chemosensory proteins，CSPs)[12]、离子受体(Ionotropic receptors，IRs)[13]、感觉神经元膜蛋白(Sensory neuron membrane proteins，SNMPs)[14]和气味降解酶(Odor degrading enzymes，ODEs)[15-16]等功能蛋白.气味分子等化学信号通过感受器小孔进入感受器管腔，并通过淋巴液扩散，淋巴液中含有多种蛋白，其中包括气味结合蛋白等，气味结合蛋白与气味分子结合到达嗅觉感受器，激活受体，以上过程是生物感受外界气味信息的第一步.文献报道昆虫可以通过嗅觉特异性感知环境中的气味分子，从而指导其行为.例如Gao等[17]在研究赤拟谷盗幼虫接触北艾挥发油的机制时，发现赤拟谷盗幼虫的OBP/CSP等蛋白表达量显著上调，当使用RNAi抑制TcOBP11与TcCYP4BN6表达时，赤拟谷盗幼虫在接触北艾挥发油后，致死量显著增加，提示TcOBP11可以通过驱使赤拟谷盗远离北艾挥发油，参与到赤拟谷盗防御机制中.

昆虫气味结合蛋白的特性对赤拟谷盗防治有着特殊意义，而在生物防治过程中，采用环保、经济的天然植物挥发油制成的驱避剂不仅具有环保及商业价值，也成为研究的热点，赤拟谷盗作为第二大模式昆虫，研究其气味结合蛋白亦对昆虫气味结合蛋白的总体研究进展有着重要的影响.

1 气味结合蛋白

目前，学界对昆虫OBPs研究较为丰富，研究发现OBPs多储存在昆虫的嗅觉受体神经元周围的细胞外液之中和感受器的淋巴液之中.OBPs是一类水溶性小分子蛋白，一般偏酸性，典型的OBPs通常由120～150个氨基酸组成[18]，它属于载体蛋白超家族——脂质蛋白.昆虫的OBPs与脊椎动物的OBPs具有不同的折叠模式，脊椎动物OBPs通常由8个β-筒状结构和羧基末端1个α-螺旋组成，而昆虫OBPs则是由6个α-螺旋所组成，且排列紧凑，包围出1个疏水腔[19-22].昆虫的OBPs结构中还通过3个二硫键进行稳定结构，使其具有更好的热稳定性与保守性.

OBPs传递气味分子的功能最早见于鳞翅目类昆虫的触角之中，对多种昆虫的体内克隆，均得到了OBPs基因，其不同种类间存在极大差异.

2 气味结合蛋白的种类

第一个鉴定出的昆虫OBPs为1981年Vogt等[23]从多音大蚕蛾中得到的性外激素结合蛋白(pheromone-binding proteins，PBPs)，随后越来越多的OBPs被鉴定出来.昆虫嗅觉感受器中含有大量OBPs.Engsontia等[8]研究发现，赤拟谷盗相较于其他昆虫具有更多的气味受体基因，在341个气味受体基因中，含有259个气味结合蛋白基因.目前许多研究将OBPs分为3个亚家族，包含PBPs[23]与普通气味结合蛋白(general odorant-binding proteins，GOBPs)，PBPs主要分布在雄性昆虫体内，而GOBPs则与之有根本不同，在雄性雌性体内皆有分布与表达，其基因序列具有高度保守性，在不同物种之中可能具有相似作用，一般认为与PBPs不同的是，GOBPs除了能结合性激素外，也发挥着与一般气味分子结合的功能，因此被称为GOBPs，且根据其保守氨基酸序列不同又可分为GOBPs1与GOBPs2[10].不同亚家族的OBPs具有不同的特性，且与不同气味特异性识别感觉神经元相关.还有一些研究依据保守的半胱氨酸数量和特征将OBPs分为经典OBPs(含有6个半胱氨酸残基)、Plus-C OBPs(较经典OBPs多出1个脯氨酸和2个半胱氨酸残基)、Atypic OBPs(非经典气味结合蛋白具有9～10个半胱氨酸残基位点)和Minus-C OBPs(较经典OBPs缺少2个半胱氨酸残基).

3 气味结合蛋白的表达分布

对于赤拟谷盗OBPs表达部位，Dippel等[24]研究发现，赤拟谷盗50个OBPs中，共49个分别在赤拟谷盗触角、头、口器、腿及躯干中有表达，并通过MALDI-TOF MS蛋白质指纹图谱分析发现，有3个经典OBPs和大部分C-OBPs在其他部位有表达，这说明昆虫OBPs表达不仅仅局限在触角中.现代研究也发现，昆虫OBPs在其他部位也有高表达，与上述论述相符，如南方家蝇库蚊[25]、冈比亚按蚊[26]、蜜蜂[27]、烟草烟粉虱[28]等昆虫的某些OBPs，在昆虫的其他部位也有高表达现象.

研究亦发现，赤拟谷盗大多数经典OBPs集中分布在触角、腿和口器等部位的化学感受器中，20个经典OBPs中的15个在触角及口器中显著表达[24].目前研究发现，OBPs大量分布于感受器的淋巴液中.电镜扫描结果显示，赤拟谷盗成虫不同性别，其触角形态类似，共有5种感受器，分别为Bohm氏鬃毛、毛形感受器、刺形感受器、锥形感受器和栓锥形感受器，上述感受器仅在长度上不相同，而其中毛形感受器1型(ST1)、分叉锥形感受器(SB1)、锥形感受器2型(SB2)、锥形感受器3型(SB3)、锥形感受器4型(SB4)被推测具有嗅觉感受功能或化学感受功能[29].

大量研究发现，不同龄、性别昆虫OBPs表达量亦不同.如张颖[30]通过蛋白印迹分析发现SzeaOBP1和SzeaOBP28虽在玉米象幼虫及成虫阶段都有表达，然而表达量并不相同，SzeaOBP10和SzeaOBP40在低龄幼虫中表达更为丰富；松褐天牛MaltOBP9基因在雌虫中表达显著高于雄虫[31].针对赤拟谷盗各阶段及不同性别之间表达量的差异，目前尚不明确.

4 气味结合蛋白的生理功能

在参与昆虫行为时，OBPs能对识别外界气味分子起重要作用.一般认为，OBPs的作用是对某些气味分子特异性识别并结合，助溶并运输气味分子，以及使已完成刺激的气味分子失活等.OBPs在参与昆虫生理及行动过程中主要存在3种假说机制：1)OBPs与气味分子结合，形成复合物，使脂溶性的气味分子水溶性增大，最终以复合物的形式同受体分子结合[32]；2)OBPs先与气味分子结合形成复合物，通过淋巴液后解离[33]；3)OBPs与气味分子结合形成复合物，再通过淋巴液并不及时解离，而是先与受体膜的跨膜蛋白结合，在该作用下，促进气味分子和OBPs解离[34].无论哪一种机制都认为，OBPs与气味分子的特异性结合能增强气味分子的水溶性，并通过感受器中水溶性的淋巴液到达神经树突上的受体，使气味受体接受刺激，最终气味降解酶将气味分子降解，避免持续刺激达到保护作用.图1所示昆虫感受器内气味结合蛋白识别运输气味分子过程.

图1 昆虫感器内气味结合蛋白识别运输气味分子过程

OBPs可能使赤拟谷盗避开某种有害物质气味源，或以使其趋向某种气味源等方式指导并参与赤拟谷盗行为调节.Zhang等[35]研究报道，中药艾蒿挥发油对赤拟谷盗具有较强的触杀作用，且显著诱导赤拟谷盗OBPC11基因.研究亦发现，针对赤拟谷盗OBPC11进行RNA干扰后，赤拟谷盗在接触艾蒿挥发油后具有更高的死亡率，提示赤拟谷盗OBPC11基因与赤拟谷盗的防御机制有关.Conteras等[36]研究发现，赤拟谷盗幼虫在防御特异性苏云金芽孢杆菌Cry毒性时，OBPC12等蛋白表达量显著性上调，通过使用RNA抑制敲除OBP基因后，研究验证了赤拟谷盗OBP参与到防御过程中，提示OBP参与赤拟谷盗幼虫的基础防御机制.李豫强等[37]研究小麦气味中诱集赤拟谷盗，发现2-庚酸、己酸、辛酸等与小麦细麸皮混合后，可提高小麦对赤拟谷盗的诱集效果，提示赤拟谷盗可感知3种成分，并引诱赤拟谷盗.研究发现[38]，赤拟谷盗感染缩小膜壳绦虫后，其性外激素结合蛋白显著上调，提示其可能参与赤拟谷盗防御机制，但具体机制尚不清楚.

5 气味结合蛋白的研究方法

5.1 获取方法

在对OBPs研究时，体外研究是常采用的手段，通过对离体蛋白进行测定，可以对其结合特性进行一系列的研究，以解释其表达特性、分布规律、结合靶点等.经典的OBPs研究方法往往采用从昆虫体内直接提取的方法.然而，由于昆虫体内OBPs含量并不足以支撑实验所需，如果想要得到足以达到实验所需的蛋白量，则需要大量的昆虫样本，因此目前研究人员常采用基因克隆，原核表达的方式，即先构建所需基因序列，克隆后连接表达载体即质粒，之后转入原核细胞中诱导表达，最终在体外完成表达得到重组蛋白，再通过亲和层析柱对蛋白进行纯化，得到纯化蛋白的方法.孙小洁等[39]通过该方法得到绿盲蝽的气味结合蛋白AlucOBP33蛋白；张颖[30]亦通过SzeaOBPs的序列分析及原核表达最终得到SzeaOBP1与SzeaOBP40；李秋玲[40]通过构建班氏跳小蜂触角转录组，并以表达量为挑选标准得到一部分基因序列，通过以上方法，最终得到大量的AbamOBPs；余海忠[41]通过该方法得到二化螟GOBP2.在测定昆虫OBPs表达特性时，常采用实时荧光定量PCR等手段来分析其表达规律及分布特点，研究OBPs的表达规律与分布特点亦有助于理解OBPs的生理功能.

5.2 检测方法

在探究昆虫OBPs功能的过程中，测定OBPs与气味分子的结合能力是一项重要的工作，并且，由于OBPs的功能特性，通过测定某种特定昆虫OBPs与特定的气味分子结合能力，往往可以推断出该气味分子是否对昆虫的行为产生影响，从而可以筛选出能够实现目标价值的驱避剂、杀虫剂，甚至扩展昆虫OBPs应用场景，实现对某种特定挥发性分子的识别与捕捉.目前，对于昆虫OBPs的研究方法主要包括分子对接技术、荧光竞争性结合实验、荧光猝灭实验和同源建模等，这些技术在研究昆虫OBPs与目标分子的结合机制研究中被广泛应用.分子对接技术往往先通过对蛋白质3D建模，而后通过DOCK、Auto DOCK或FlexX等分子对接软件进行刚性对接、半柔性对接或柔性对接匹配，如Zhang等[42]就通过Auto DOCK软件实现对柑橘木虱OBPs和CSPs的分子对接实验，完成对柑橘木虱OBPs结合的分子机制研究.然而分子对接技术只是计算机系统上模拟OBPs与气味分子的结合，结果仍需其他实验进行佐证，在单独作为例证时存在一定的争议.荧光竞争性结合实验常用来检验所得到的OBPs和CSPs与目标配体结合的情况，其基本原理：当气味分子进入OBPs疏水腔时，与腔内氨基酸残基结合，而荧光分子探针与疏水腔内氨基酸残基亦发生分子间作用力，并在特定波长下，激发出荧光，气味分子和荧光分子探针与OBPs发生竞争性结合，因此，气味分子与OBPs结合能力越强，荧光强度越弱.Li等[43]得到梨小食心虫的GmolOBP12和GmolOBP16，通过荧光竞争性结合实验发现，二者均与宿主植物挥发性物质梨酸酯亲和力强，且能特异性识别其他某些化学物质.相较于分子对接技术，荧光竞争性结合实验针对离体蛋白进行实验具有更好的说服力.然而，无论是通过原核生物(或真核生物)构建的OBPs还是纯化分离所得到OBPs，其体内外生物活性是否具有一定差异，而这种差异是否会引发实验数据结果误差，仍在学界广泛讨论中.

6 展望

目前，许多研究发现，天然植物提取物对昆虫具有驱避、触杀等作用.Zhang等[44]报道，北艾挥发油对赤拟谷盗具有触杀作用，可用于对赤拟谷盗的防治；Chen等[45]报道北苍术挥发油对赤拟谷盗以及嗜卷书虱具有触杀和驱避作用；Abouelatta等[46]报道天竺葵挥发油对赤拟谷盗及谷蠹具有显著的驱避、触杀及熏蒸活性；韩群鑫等[47]报道丁香花蕾粉末与丁香酚对黑菌虫具有驱避作用，对烟草甲具有引诱作用，其中丁香酚为主要化学作用物质，研究同样发现丁香对赤拟谷盗具有驱避作用；Kheloul等[48]发现薰衣草挥发油对赤拟谷盗具有驱避效应.因此在天然植物挥发油中寻找合适的物质，对赤拟谷盗等害虫进行防治得到学界的广泛关注，具有非常重要的意义.然而目前，关于赤拟谷盗OBPs的组织分布情况，不同龄、性别中的不同蛋白表达差异研究仍不足，有待进一步考察，而分布情况及差异不仅在对赤拟谷盗防治工作中，也在天然植物挥发性物质对赤拟谷盗的驱避、触杀作用机制研究中非常重要.如何选择合适的物质在特定的时间段对赤拟谷盗进行防治，影响其繁殖等行为，以达到最佳防治效果，值得学界对赤拟谷盗OBPs进一步研究，也同样对其他种害虫防治具有借鉴意义.

在采用天然植物挥发油对赤拟谷盗的驱避、触杀、熏蒸及胃毒等研究实验中，针对赤拟谷盗OBPs通过何种机制影响赤拟谷盗的行为的研究仍存在不足.PBPs是OBPs家族中重要一员，在昆虫繁衍过程中起关键作用，然而实验中亦发现PBPs也可能参与到昆虫的防御机制中，那么，PBPs如何参与到赤拟谷盗防御机制中，亦需要进一步的研究证实.是否能利用PBPs对昆虫进行防治，抑制其繁殖从而对害虫进行防治，保护储粮安全，及关于PBPs的生理功能和意义亦值得学界进一步研究探索.

当前针对OBPs的研究方法，多数集中在对昆虫离体蛋白的研究，而离体蛋白尽管在结构上可以保持与体内蛋白一致，但是二者的生理功能是否存在差异仍有疑点，受到学界的质疑.若能采用体内蛋白进行实验可能是更好更具有说服力的一种方法.将计算机系统模拟实验与体内外实验相结合，亦是一种较好的实验方式.采用计算机系统模拟实验对蛋白与配体进行筛选，对蛋白与配体结合时的作用力进行理论分析，可大幅度减少实验成本，节省时间，同时也为体内外实验提供一些理论支持.

通过研究昆虫OBPs有助于深入理解昆虫化学感器，更好地理解昆虫的自然行为，从而创造更高的经济效益，筛选出环保与经济并重的化学驱避剂或天然植物驱避剂.同时，OBPs作为载体蛋白，具有识别、运输气味分子的能力，因此对OBPs的研究不应仅局限于害虫的防治，还可应用于挥发性物质识别装置，具有广阔的发展前景.