千金藤素通过调控p53信号介导的自噬逆转人非小细胞肺癌细胞的埃克替尼耐药性

刘然 邢爽 王璐 张怡 许保海

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是最常见的肺癌形式，约占所有肺癌病例的85%，其五年生存率很低，仅为15%[1-2]。化学疗法和靶向疗法显著改善了患者的预后。然而，当癌细胞对药物治疗产生抗药性时，一些患者会复发，这代表了重要的临床局限性[3-4]。埃克替尼(Icotinib)是第一代表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)-酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitor，TKI)，具有方便、高效、低毒的特点[5-6]，已被中国食品药品监督管理局(CDFA)批准为激活EGFR突变的NSCLC患者的一线治疗药物，但是几乎所有接受治疗的患者经过9～15个月无进展生存期后，都不可避免地出现耐药性，导致治疗失败[7]。因此，深入探讨EGFR-TKI耐药肺癌细胞的作用机制，对于探索新的耐药逆转策略具有重要意义。千金藤素(Cepharanthine)是从中药千金藤中提取的异喹啉生物碱，临床主要用于白细胞减少症，研究表明千金藤素在多种肿瘤中具有抗肿瘤活性和抗多药耐药的作用；可诱导人卵巢癌SKOV3细胞自噬，抑制细胞活力[8]；能逆转人鼻咽癌多药耐药细胞CNE2/ADM的耐药性[9]；与多柔比星联合应用能逆转人类髓性白血病细胞K562/ADR对多柔比星耐药性[10]。但是千金藤素能否逆转人NSCLC细胞的埃克替尼耐药性还未可知，因此本研究旨在探讨千金藤素对人NSCLC细胞的埃克替尼耐药性的影响及可能的作用机制。

资料与方法

一、实验细胞

人NSCLC细胞PC-9(ATCC)购自上海冠导生物工程有限公司，货号：DA-C5037。

二、药物、仪器与试剂

胎牛血清(10099-141)、DMEM培养基(10569-010)(美国Gibco公司)，埃克替尼(浙江贝达药业有限公司，国药准字H20110061)，Pifithrin-α(PFT-α，p53抑制剂，上海信裕生物科技有限公司，货号：XY-1816)，MTT试剂盒(C0009S)、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(C1062L)、RIPA裂解液(P0013B)、BCA试剂盒(P0010)(碧云天生物科技公司)，6-氨基-3-甲基嘌呤(3-MA，美国Sigma-Aldrich公司，货号：M9281)；细胞自噬染色检测试剂盒(MDC法)(南京森贝伽生物公司，货号：SBJ-1661)，兔抗人p53(ab32389)、mTOR(ab32028)、p-mTOR(ab137133)、Beclin-1(ab207612)、LC3A/B(ab128025)、β-actin(ab8227)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)(英国abcam公司)，细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)，IX73倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)，H-7500透射电子显微镜(日本日立公司)，iMark680多功能酶标仪、蛋白转膜装置、BD FACSCanto Ⅱ流式细胞仪(美国Bio-Rad公司)。

三、细胞培养及NSCLC埃克替尼耐药细胞PC-9/Icotinib resistance(IR)的建立

采用埃克替尼浓度递增、不断作用的方式诱导PC-9细胞耐药。PC-9细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，取对数生长期PC-9细胞，用质量浓度为0.5 μmol/L的埃克替尼刺激作用24 h，然后换新鲜的DMEM培养基继续培养，直到细胞形态恢复到正常生长状态，长满培养皿后进行传代，再用0.5 μmol/L的埃克替尼作用24h，反复换液、传代，直至在同一浓度药物作用下细胞生长不受影响，逐渐增加埃克替尼浓度进行不断筛选培养，直至PC-9细胞能在含浓度为20 μmol/L埃克替尼的培养基中稳定存活，记为PC-9/IR耐药细胞。

四、MTT法筛选千金藤素的实验浓度

体外细胞实验中所使用的千金藤素的浓度，以对PC-9/IR细胞不造成显著生长抑制为标准，取该浓度范围内的较高浓度为千金藤素浓度。具体操作为：取对数生长期PC-9/IR耐药细胞，以2×103细胞/孔的浓度接种到96孔板中(边缘孔用PBS填充)，待PC-9/IR耐药细胞贴壁并铺满孔底后，弃去原培养基，加入含2、4、8、16、32 μmol/L千金藤素的培养基继续培养，48h后加入5 g/L MTT试剂20 μL；继续培养4 h，吸去上层清液后加入150μl的DMSO低速震荡溶解10min；使用酶标仪检测各组细胞在490 nm处的光密度(optic density，OD)值，计算细胞增殖抑制率。将不含细胞的培养基作为空白对照组。

细胞增殖抑制率=1-(实验组OD-空白对照组OD)/(对照组OD-空白对照组OD)×100%

五、埃克替尼敏感性检测

采用MTT法检测：具体操作同1.2.2，固定千金藤素的浓度为8 μmol/L，取对数生长期PC-9/IR耐药细胞接种到96孔板中，待PC-9/IR耐药细胞贴壁并铺满孔底后，分组两组：一组只用含0、1、2、4、8、16、32、64 μmol/L埃克替尼的培养基培养，不使用千金藤素；一组用含8 μmol/L千金藤素和不同浓度(0、1、2、4、8、16、32、64 μmol/L)的埃克替尼的培养基进行培养；培养48 h后，各孔加入5 g/L MTT试剂20 μL；继续培养4 h，弃上清后加入150μL的DMSO；在490 nm处测定各组细胞的OD值，计算细胞存活率；并采用GraphPad软件计算埃克替尼对各组细胞的半数抑制浓度(the half inhibitory concentration, IC50)和逆转耐药倍数(reverse fold, RF)=IR IC50/(IR+千金藤素)共同作用下IC50。

细胞存活率=(实验组OD-空白对照组OD)/(对照组OD-空白对照组OD)×100%

六、细胞分组及处理

取对数生长期PC-9/IR耐药细胞，按每孔2×106个接种于24孔板，分PC-9/IR组(正常培养的PC-9/IR耐药细胞)、千金藤素组(PC-9/IR耐药细胞+8 μmol/L千金藤素)、埃克替尼组(PC-9/IR耐药细胞+20 μmol/L埃克替尼)、千金藤素+埃克替尼组(PC-9/IR耐药细胞用含20 μmol/L埃克替尼和8 μmol/L千金藤素的培养基共同处理)、3-MA组(PC-9/IR耐药细胞用5 mmol/L的3-MA预处理1 h，随后用含20 μmol/L埃克替尼和8 μmol/L千金藤素的培养基共同处理)、PFT-α组(PC-9/IR耐药细胞用40μmol/L的p53抑制剂Pifithrin-α预处理1 h再用含20 μmol/L埃克替尼和8 μmol/L千金藤素的培养基共同处理)，继续培养48h，收集细胞进行后续实验。

七、流式细胞术检测细胞凋亡

取对数期生长的PC-9/IR细胞，按照1.2.4项下步骤进行分组及处理，培养48h后，将培养的细胞用0.25%胰蛋白酶进行消化处理，离心，去除上清液，PBS洗涤后将细胞以1×106细胞/mL的密度重悬，加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI避光孵育15 min，按照FITC-Annexin V/PI凋亡检测试剂盒说明书步骤，使用流式细胞仪分析细胞凋亡率。

八、MDC染色检测自噬

MDC是一种嗜酸性荧光染色剂，可选择性标记酸性自噬泡，通常用作检测自噬的特异性标记。细胞按照1.2.4项下步骤进行分组及处理，培养48h后，用MDC(50 μmol/L)在37℃下避光孵育15 min，PBS洗涤两次，立即使用倒置荧光显微镜检测并拍照。平均光密度值由Image-Pro Plus 6.0版计算得出。

九、透射电镜观察细胞超微结构变化

收集各组细胞并用PBS洗涤，然后立即浸入2.5%戊二醛中在4°C下固定30 mim。将样品后固定在1%四氧化锇中1h，然后在一系列梯度乙醇中脱水。切超薄切片(50nm)，用2.5%乙酸铀酰和1%柠檬酸铅染色。用透射电子显微镜观察细胞自噬情况，并拍照。

十、Western blot检测自噬相关蛋白表达

使用RIPA裂解液提取细胞中蛋白质。使用BCA试剂盒对蛋白质浓度进行定量。取等量蛋白质样品上样(30 μg/泳道)，10% SDS-PAGE分离蛋白质，并通过半干转移将其转移到PVDF膜上。将膜用5%脱脂牛奶封闭，并在4 ℃下与一抗(p53、mTOR、p-mTOR、Beclin-1、LC3A/B、β-actin，1∶1000)孵育过夜。第二天，将膜与偶联辣根过氧化物酶的二抗孵育(1∶2000)2h，然后使用化学发光试剂盒(ECL)进行显色。以β-actin为内参，分析结果。

十一、统计学方法

结 果

一、千金藤素的体外细胞实验浓度

不同浓度的千金藤素能不同程度的抑制PC-9/IR细胞的生长(见表1)；千金藤素的浓度在2、4、8 μmol/L时对PC-9/IR细胞的抑制作用较弱，抑制率均低于5%。因此，选择8 μmol/L的千金藤素作为后续实验浓度。

表1 千金藤素对PC-9/IR细胞增殖的抑制作用

二、千金藤素对PC-9/IR细胞埃克替尼敏感性的作用

PC-9/IR细胞的存活率随着埃克替尼浓度的增加而降低，千金藤素能明显增加PC-9/IR细胞对埃克替尼的敏感性，经计算使用千金藤素后PC-9/IR细胞的IC50由43.56μmol/L下降至4.31μmol/L，其逆转耐药指数为10.11倍(见表2、图1)。为了保证细胞的存活率，故选择埃克替尼浓度为4 μmol/L与8 μmol/L千金藤素共同处理PC-9/IR细胞。

表2 千金藤素对PC-9/IR细胞埃克替尼敏感性的作用

图1 千金藤素对PC-9/IR细胞埃克替尼敏感性的作用

三、千金藤素联合埃克替尼对PC-9/IR细胞凋亡的作用

与PC-9/IR组相比，千金藤素组、埃克替尼组细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)；与单用千金藤素组和埃克替尼组相比，千金藤素+埃克替尼组细胞凋亡率显著增加(P<0.05)；与千金藤素+埃克替尼组相比，3-MA组、PFT-α组细胞凋亡率明显降低(P<0.05)；见(图2、表3)。

图2 各组细胞凋亡检测结果

表3 各组细胞凋亡率的比较

四、千金藤素联合埃克替尼对PC-9/IR细胞中自噬的影响

与PC-9/IR组相比，千金藤素组、埃克替尼组细胞绿色荧光的平均光密度值差异无统计学意义(P>0.05)；与千金藤素组和埃克替尼组相比，千金藤素+埃克替尼组细胞在细胞质和核周区显示出绿点样结构的增加，其代表成熟的自噬空泡，平均光密度显著增加(P<0.05)；与千金藤素+埃克替尼组相比，3-MA组、PFT-α组绿色荧光的平均光密度明显降低(P<0.05)；见(图3、表4)。

图3 各组细胞MDC染色结果(200×，400×)

表4 各组细胞自噬的自噬情况比较

五、各组细胞中自噬小体的形成情况

PC-9/IR组细胞显示正常的细胞质、细胞核和细胞器，没有自噬小体；千金藤素组和埃克替尼组可见少量具有双层膜结构的自噬小体形成；千金藤素+埃克替尼组细胞中可见较多的自噬小体，某些自噬小体的液泡内还包含受损的细胞器，如线粒体和内质网；3-MA组和PFT-α组细胞中自噬小体的数量较千金藤素+埃克替尼组明显减少(见图4)。

图4 各组细胞的超微结构变化(TEM，53000×)

六、各组细胞中自噬相关蛋白的表达

与PC-9/IR组相比，千金藤素组、埃克替尼组细胞中自噬相关蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)；与千金藤素组和埃克替尼组相比，千金藤素+埃克替尼组细胞p53、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达显著增加，p-mTOR/mTOR的比值显著降低(P<0.05)；与千金藤素+埃克替尼组相比，3-MA组、PFT-α组细胞p53、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达明显降低，p-mTOR/mTOR的比值明显升高(P<0.05)(见图5，表5)。

图5 各组细胞中自噬相关蛋白的表达

讨 论

癌症耐药性是临床治疗中治疗失败和患者死亡的主要原因。因此，克服癌细胞的耐药性已成为癌症治疗领域要解决的关键问题。近年来研究发现对EGFR-TKI具有高度抵抗力的细胞中，自噬并没有被上调，而这些细胞与雷帕霉素(一种自噬的诱导剂)共同处理可以部分恢复对EGFR-TKI的敏感性[11]。Liu等[12]发现β-榄香烯能通过诱导自噬逆转NSCLC细胞的吉非替尼耐药性；YM155(一种survivin小分子抑制剂)可通过诱导自噬显著增强厄洛替尼对EGFR-TKI耐药的NSCLC细胞系H1650和A549的敏感性[13]。表明自噬的诱导可能是恢复对EGFR-TKI耐药细胞敏感性的有效策略。

千金藤素在临床主要用于白细胞减少症，近年的研究发现其对多种肿瘤细胞的耐药性有逆转作用，如鼻咽癌多药耐药细胞CNE2/ADM、人类髓性白血病多柔比星耐药细胞K562/ADR；并且其对肿瘤细胞的影响与自噬密切相关[14]。项福英等[8]发现千金藤素可能通过抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路，增加SKOV3细胞内酸性自噬泡数量，诱导人卵巢癌SKOV3细胞自噬；张岩昊等[15]发现千金藤素能诱导线粒体自噬的增加，增强多柔比星抑制三阴性乳腺癌细胞增殖的活性，进而诱导细胞凋亡。本研究采用体外浓度梯度递增的方法建立NSCLC细胞PC-9的埃克替尼耐药细胞株PC-9/IR，从自噬的角度考察千金藤素对PC-9/IR细胞耐药性的作用；首先我们在细胞水平筛选千金藤素作用于PC-9/IR细胞的浓度，通过细胞毒性实验发现当千金藤素的浓度低于8 μmol/L时对PC-9/IR细胞不产生明显的抑制作用(抑制率<5%)，因此选择此浓度作为后续耐药性逆转实验中千金藤素的浓度。随后我们将低毒剂量的千金藤素与不同浓度的埃克替尼共同作用于PC-9/IR细胞，通过细胞增殖情况来评价联合用药后PC-9/IR细胞对埃克替尼敏感性的变化，发现千金藤素与埃克替尼联合用药后，相比埃克替尼单独用药，PC-9/IR细胞的存活率显著降低，PC-9/IR细胞的IC50由43.56μmol/L下降至4.31μmol/L，其逆转耐药指数为10.11倍，说明千金藤素能逆转PC-9/IR细胞的埃克替尼耐药性。为了进一步探究千金藤素对PC-9/IR细胞的埃克替尼耐药性的逆转作用是否与自噬相关，我们采用透射电子显微镜和MDC染色观察细胞自噬情况，发现千金藤素与埃克替尼联合应用可显著增加PC-9/IR细胞中自噬空泡和自噬小体的数量，促进细胞凋亡，而经过自噬抑制剂3-MA预处理的PC-9/IR细胞，自噬空泡和自噬小体的数量均减少，能降低千金藤素与埃克替尼联合应用时对PC-9/IR细胞凋亡的促进作用；提示千金藤素逆转PC-9/IR细胞的埃克替尼耐药性与促进细胞自噬有关。但其具体通过何种途径发挥作用，尚不清楚。

近年来研究表明，抑癌基因p53作为一种重要的转录因子，在细胞周期阻滞、凋亡中都发挥着重要作用；并且参与自噬活性的调节。约50%的晚期NSCLC病例中发生p53突变，导致肿瘤抑制功能丧失。重新激活突变型p53，从而诱导癌细胞凋亡是p53靶向治疗的目标[16]。NSCLC组织中p53表达水平与细胞凋亡呈正相关[17]。Fan等[18]发现白藜芦醇可能通过p53介导的信号传导途径诱导NSCLC A549细胞凋亡和自噬；黄芩苷能通过激活p53途径提高顺铂诱导的细胞凋亡和自噬以克服NSCLC的顺铂耐药性[19]；重楼皂苷可上调p53，诱导caspase依赖性凋亡，并抑制mTOR信号传导，进而抑制抗顺铂的人NSCLC细胞系A549/DDP细胞的增殖，诱导细胞凋亡和自噬[20]。另有研究发现异喹啉生物碱(包括千金藤素)是一种新型的AMPK激活剂可诱导耐药性癌症中的自噬细胞死亡[21]；Unson等[22]发现千金藤素是用于治疗具有p53突变的结直肠癌患者的有前途的药物；而且能够上调p53蛋白表达，抑制肺癌A549细胞生长，促进其凋亡[23]。本研究发现，千金藤素与埃克替尼联合作用于PC-9/IR细胞时，可上调p53、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达，并抑制p-mTOR的表达，使用3-MA预处理的PC-9/IR细胞中p53的表达降低，而且p53抑制剂Pifithrin-α可减少千金藤素诱导的细胞凋亡和自噬；提示千金藤素可能通过上调p53的表达，诱导PC-9/IR细胞自噬，促进其凋亡。

综上所述，千金藤素可能通过激活p53介导的自噬，逆转PC-9/IR细胞的埃克替尼耐药性。由于p53在自噬中的调控比较复杂，其对自噬的调控作用受细胞所处的环境和所受的压力及其亚细胞定位的影响，其具体的作用机制有待进一步深入研究。