晚期糖基化终产物受体阻断剂FPS-ZM1减缓ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化进展的作用△

谢 妃，吴岳恒，林吉进，1

［1.华南理工大学医学院，广州 510006；2.广东省心血管病研究所心内科广东省人民医院（广东省医学科学院），广州 510080］

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种以血管壁纤维增生、慢性炎症、脂质积聚和免疫功能紊乱为特征的病理疾病［1］。随着粥样斑块的不断进展，不稳定斑块容易破裂，导致急性心血管事件，而斑块发生破裂则与局部的炎症反应、血栓形成以及蛋白降解有密切关系［2］。虽然低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）仍然是AS 最重要的危险因素，但近年来，AS 的免疫和炎症机制引起了人们极大的兴趣，目前针对炎症反应这一靶点来干预AS 发展的方法尚不成熟［1，3-4］。晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end products，RAGE）是一类属于免疫球蛋白家族的多配体受体，能与晚期糖基化终末产物（ad⁃vanced glycation end products，AGEs）、S100/钙粒蛋白家族、高迁移率族蛋白1（high mobility group box，HMGB1）等配体结合发挥促炎作用［5］，并在AS 中起重要作用，在AS 患者中血浆AGEs、S100/钙粒蛋白家族、HMGB1、RAGE 浓度均升高［6-8］，同时伴随各炎症因子升高，其与炎症反应关系密切，深入探究RAGE 在AS 中的炎症机制可为AS 治疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要药品与试剂

FPS-ZM1 粉末（selleck，s8185），用DMSO 配备10 mg/mL 的FPS-ZM1 储备液，临用前用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）配置成工作液腹腔注射给药；高脂饲料及纯化对照饲料（江苏协同医药生物工程有限责任公司，XT108C）；饱和油红O染液（上海索莱宝生物科技有限公司，G1015）；苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（上海爱必信生物科技有限公司，abs9217）；RAGE抗体（Abcam，ab37647）；小鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（CUSABIO，CSB-E04741m）；小鼠纤溶酶原激活物抑制物-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）ELISA 试剂盒（CSB-E07947m）。

1.2 主要仪器

XTL250 型体式显微镜，全自动血生化分析仪（日本日立）；病理切片机（赛默飞世尔科技）；正置显微镜（奥林巴斯有限公司）；成像系统（日本滨松）；全波长酶标仪Multiskan GO（Thermo Scien⁃tific）。

1.3 动物分组及给药

6 周龄雄性无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级ApoE-/-小鼠购自广东药康生物科技有限公司，体质量20～25 g，在华南理工大学实验动物中心SPF 级动物房中饲养，检疫1 周，适应性喂养1 周后，ApoE-/-小鼠随机分成对照组（CTRL组，纯化对照饲料喂养），AS 模型组（AS 组，高脂饲料喂养），FPS-ZM1 干预组（FZM1 组，高脂喂养加FPS-ZM1 腹腔注射），每组8 只。ApoE-/-小鼠高脂喂养8 周后，开始腹腔注射给药，连续4 周，FPS-ZM1 干预组给予1 mg·kg-1·d-1的FPS-ZM1［9］，其余组给予PBS 作为对照。每周根据小鼠体质量变化调整给药。

1.4 小鼠血脂浓度测定

摘除小鼠眼球取血，收集于乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）采血管，分离血浆，分装后-80 ℃保存直至使用。采用全自动生化仪测定血浆三酰甘油（triacylglycerol，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein-cho⁃lesterol，HDL-C）浓度。

1.5 小鼠主动脉取材

眼球取血后采用颈椎脱臼法将ApoE-/-小鼠处死，开胸开腹后剪除右心耳，用预冷的PBS 从左心室开始灌流，直至肝脏发白，分离心脏，以主动脉根部为起点，沿脊柱旁仔细快速分离主动脉至髂总动脉分叉处为止，后转移至体式显微镜下，于装有预冷的PBS 的皿中操作，仔细剥离主动脉周围组织，自主动脉根部上1 cm 处左右垂直分离主动脉，近端主动脉根部置于4%多聚甲醛溶液固定，用于包埋切片。远端主动脉置于液氮速冻后保存于-80 ℃用于蛋白质免疫印迹实验。

1.6 小鼠主动脉切片油红O、苏木素伊红染色

将4%多聚甲醛固定的小鼠主动脉根部置于蔗糖溶液脱水后，使用OCT 包埋，切片厚6 μm，每隔10 张收取3 张，每只小鼠取15 张，5 张用于油红O 染色，5 张用于HE 染色，5 张用于免疫组化检测RAGE表达［10］。用于油红O染色的切片于60%异丙醇中漂洗20 s，取油红O 贮备液6 mL，加蒸馏水4 mL，混合后静置10 min，过滤后用于染色。油红O 染色时间为5 min；60%异丙醇稍洗去多余染液，蒸馏水洗；Mayer 苏木素浅染核1 min，1%盐酸酒精稍分化，水漂洗10 min，用滤纸将切片周围水分抹干，封片。HE染色按HE试剂盒说明书操作。采用Image pro plus 6.0软件测量主动脉斑块面积比（%）。

1.7 切片免疫组织化学染色

测定小鼠主动脉组织RAGE 表达：各组主动脉组织常规包埋、固定、切片，将切片脱蜡复水后，采用热修复法进行抗原修复，采用试剂盒进行免疫组化染色，在光学正置显微镜非重叠视野下分别观察组织着色情况。采用Image pro plus 6.0 软件对主动脉组织RAGE 表达情况进行半定量。

1.8 Western blot 检测

将小鼠主动脉组织剪碎，加入组织裂解液抽提蛋白，用二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒（碧云天）测定总蛋白浓度，加入一定比例的蛋白上样缓冲液，95℃金属浴10 min，取20 μg 蛋白进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，5%脱脂牛奶封闭1 h，进行一抗（RAGE，1∶1 000）孵育，4℃过夜，洗膜3 次，每次5 min，进行HRP 标记的二抗（1∶1 000）孵育，4 ℃1 h，洗膜，最后化学发光试剂（ECL）显色进行扫描拍照，采用Imge J 计算灰度值来表示RAGE 的相对表达量。

1.9 酶联免疫吸附试验测定

将保存于-80 ℃的血浆逐级解冻，按照ELISA试剂盒说明测定血浆样本中TNF-α以及PAI-1的浓度。

1.10 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0.2 统计软件处理数据。计量资料以（）表示，单因素多样本组间均数比较采用one-way ANOVA 分析，多因素多组间均数比较采用two-way ANOVA 分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组小鼠血脂浓度比较

与对照组（CTRL）比较，AS模型组ApoE-/-小鼠血浆TC、LDL-C浓度均显著增高（P＜0.05），但TG 浓度下降（P＜0.05），HDL-C 浓度无明显变化；FPSZM1 干预组（FZM1）血脂各指标与对照组及AS 模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1 3 组小鼠血浆TG、TC、LDL-C 和HDL-C 浓度比较柱状图（n=8）

2.2 3 组小鼠主动脉根部切片油红O 染色、苏木素伊红染色比较

油红O 染色镜下观察正常对照组（CTRL）小鼠主动脉内膜下油红O 染色红色着色区少，AS 模型组小鼠主动脉内膜下红色着色区显著增加（P＜0.01），FPS-ZM1 干预组（FZM1）小鼠主动脉内膜下着色区域较AS 模型组减少（P＜0.01），见图2A和2C。HE 染色镜下观察正常对照组小鼠主动脉内膜光滑完整，AS 模型组小鼠主动脉局部内膜明显增厚，斑块突向管腔，内膜下有大量泡沫细胞聚集和脂质沉积，中层弹力纤维破坏、排列紊乱，并有炎症细胞浸润，且斑块面积比例较AS 模型组显著增加（P＜0.01），而FPS-ZM1 干预组小鼠主动脉只有少量泡沫细胞，斑块面积较AS 模型组明显减低（P＜0.01），见图2B 和2D。

图2 3 组小鼠主动脉根部切片油红O 染色、HE 染色结果比较（比例尺=100 μm；n=8；A 图为3 组小鼠主动脉根部切片油红O 染色镜下图像比较；B 图为3 组小鼠主动脉根部切片HE 染色镜下图像比较；C 图和D 图分别为3 组小鼠主动脉根部切片油红O 染色、HE 染色结果比较柱状图）

2.3 3组小鼠主动脉Western blot、主动脉切片RAGE免疫组化染色比较

与对照组（CTRL）比较，AS 模型组ApoE-/-小鼠主动脉Western blot 结果显示RAGE 表达显著增高（P＜0.01），FPS-ZM1 干预组（FZM1）小鼠RAGE蛋白表达量较AS 模型组降低（P＜0.05），见图3A和3C。主动脉切片免疫组化染色结果与蛋白免疫印迹实验一致，AS 模型组小鼠主动脉较对照组平均光密度值（AOD）显著增加（P＜0.01），而FPSZM1 干预组（FZM1）小鼠主动脉免疫组化染色较AS 模型组有所减低（P＜0.05），见图3B 和3D。

图3 3 组小鼠主动脉Western blot、主动脉切片RAGE 免疫组化染色比较（比例尺=100 μm；n=8；A 图为3 组小鼠主动脉RAGE 的Western blot 结果比较；B 图为3 组小鼠3 组小鼠主动脉切片RAGE 免疫组化染色镜下图像比较；C 图为3 组小鼠主动脉Western blot、主动脉切片RAGE 免疫组化染色比较柱状图）

2.4 3组小鼠血浆酶联免疫吸附试验测定结果比较

与对照组（CTRL）比较，AS 模型组的ApoE-/-小鼠血浆中TNF-α、PAI-1 浓度均显著升高（P＜0.01）；与AS 模型组比较，FPS-ZM1 干预后（FZM1）ApoE-/-小鼠血浆TNF-α、PAI-1 浓度下降（P＜0.05），见图4。

图4 3 组ApoE-/-小鼠血浆TNF-α 和PAI-1 的ELISA测定结果比较（n=8）

3 讨论

AS 是导致心血管疾病最常见的病理基础，心血管疾病是以粥样硬化斑块形成为特点的大、中动脉疾病，斑块内包括坏死组织、钙化结晶、修饰的脂质聚集、炎症平滑肌细胞（SMCs）、内皮细胞（ECs）、白细胞和泡沫细胞。AS 斑块的这些特征表明，AS 是一种复杂的疾病，血管、代谢和免疫系统的许多成分参与了这一过程。近年来，AS 的免疫和炎症机制引起了人们极大的兴趣，炎症因子与炎症细胞在AS 中起重要作用［3］。

AS 是大动脉内皮下脂质驱动的慢性炎症过程，ApoE-/-小鼠高脂喂养可以最大限度地模拟人类各个阶段的AS 病变。本研究采用主动脉切片油红O 染色、HE 染色观察小鼠主动脉AS 病理形态学改变进行AS 指标定量检测，结果均表明12 周高脂饮食可诱发ApoE-/-小鼠出现严重的高脂血症和明显的主动脉病变。血脂检测结果还发现RAGE 拮抗剂FPS-ZM1 对ApoE 小鼠的高血脂各指标均无影响，表明抑制RAGE 对AS 病变的影响与调控血脂无关，这与Mitchell 等［11］的研究结果一致，RAGE 的敲除对循环中脂质无影响。

RAGE 是一种1 型跨膜糖蛋白，由于其胞外区域中存在多个Ig 样结构域，因而认为是受体Ig 超家族的成员。细胞外区域包含三个Ig 结构域，包括V 型结构域，C1 型结构域和C2 型结构域。配体的结合主要发生在V 型结构域中。细胞外区域后面是单个跨膜区域和一个短的，带高电荷的胞内段结构域（ctRAGE），其与胞内衔接蛋白结合对下游信号传导至关重要［5，12］。RAGE 因能与AGE 结合而得名，后研究发现RAGE 基于电荷和多聚体状态可结合许多内源性非AGE 配体，比如S100/钙粒蛋白家族、HMGB1 等等。S100/钙粒蛋白家族、HMGB1、AGEs 均与炎症反应有密切关系，且在AS时表达有所增加［6，13-14］。这些配体与RAGE 结合可刺激活性氧（reactive oxygen species，ROS）、促炎性细胞因子、细胞黏附分子的产生和促血栓形成，活化核因子κB（nuclear factor Kappa-B，NF-κB）能进一步上调RAGE 表达，使得炎症级联反应持续发生，这些都与心血管疾病的病理生理有关［15］。FPS-ZM1 可通过竞争性结合RAGE V 型结构域，阻碍RAGE 与其他配体结合，从而抑制RAGE 下游信号传导［16］，从而减弱其生物效应。由于RAGE胞浆结构域缺乏内源性激酶活性，其发出信号并影响转录程序和细胞功能的方式一直不明确，直到发现哺乳动物透明蛋白1（forin diaphanous-1，DIAPH-1）才得以阐明。RAGE 的胞质结构域主要是氨基酸R366/Q367，通过与DIAPH-1 的福尔曼同源1（FH1）结构域结合来传导信号；当这些氨基酸突变为丙氨酸或将DIAPH-1 敲除后会导致RAGE 与DIAPH-1无法结合［17］，FPS-ZM1在RAGE 胞质结构域与DIAPH-1相互作用中的影响有待探索。

本实验中，在ApoE-/-小鼠中应用FPS-ZM1抑制RAGE 信号后发现AS 斑块有所减轻，且抑制促炎因子TNF-α 的释放，减轻AS 的炎症。组织纤溶酶原激活剂（t-PA）和PAI-1 是纤溶系统的一对重要的调节因子，主要由血管内皮细胞产生和分泌。当内皮细胞组织纤溶酶原激活剂/PAI-1 的动态平衡被打破时，血栓形成的风险增加。RAGE抑制剂在AS 模型小鼠中的使用可减少PAI-1 的释放，从而降低心肌梗死并发症的可能性。

综上所述，本研究在高脂诱发的ApoE-/-小鼠AS 模型中，通过RAGE 阻断剂FPS-ZM1 的干预减缓了AS 的进展，且AS 斑块的减少与血脂调控无关，同时FPS-ZM1 抑制了促炎因子TNF-α 和促血栓因子PAI-1 的释放。本研究结果将为开发以RAGE 为靶点的预防AS 药物提供理论基础。