液相色谱-串联质谱法测定高血压患者血浆中标记物的质量浓度△

李云鹏，王 皓，熊雪莲，许 浩，陈 俊，杨汉东，蔡玉华

（1.湖北医药学院附属东风医院心血管内科，湖北十堰 442000；2.湖北医药学院附属东风医院耳鼻喉科，湖北十堰 442000；3.长江大学附属荆州市第一人民医院心血管内科，湖北荆州 434000）

原发性高血压（高血压）为常见的慢性疾病，也是集多个风险因素为一体的综合性代谢紊乱临床疾病。该病发生的具体机制还不明确，但是病因涉及到肥胖、糖代谢紊乱、脂代谢紊乱等［1-2］。已有研究显示高血压与糖尿病、心血管疾病紧密相关，故研究高血压的病理生理机制并对其进行早期诊治具有重要价值［3］。已有研究认为遗传、环境因素在高血压的发生、发展中起到了重要的作用，涉及的发病学说包括能量代谢异常、神经递质功能异常、神经发育异常等［4-5］。代谢组学是从整体的角度研究生物系统的代谢变化，其已经被应用于糖尿病、代谢综合征等疾病的发病机制探索，也发现了一些血浆标记物［6］。由于代谢组学分析的对象种类比较复杂，单独的分离分析手段很难得到全面的结果［7］。液相色谱-串联质谱（liquid chromatogra⁃phy-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法具有灵敏度高、分辨率佳等优点，且对于样本的处理比较简单迅速，可实现对目标化合物进行准确迅速的定性分析［8-10］。本文建立了LC-MSMS法测定高血压患者血浆中标记物质量浓度的体系，希望能找出了与高血压紧密相关的潜在标记物，为了解高血压的病理生理机制提供参考。现总结报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料

研究对象：研究时间为2018 年2 月到2019 年5 月，本研究得到了本院伦理委员的批准，也得到了所有入选者的知情同意。选择在本院进行诊治的高血压患者78 例（高血压组）与进行体检的健康人78 名（健康组）为研究对象。

纳入标准：（1）年龄18～60 岁；（2）入组前2 周未服用过其他药物；（3）既往未曾服用过任何抗高血压药物；（4）无严重躯体疾病；（5）本地户籍或在本地区居住≥3 年。

排除标准：（1）器质性精神障碍患者；（2）孕妇或准备怀孕；（3）有严重自杀倾向的患者；（4）检测资料缺乏的患者；（5）合并心、脑、肾等躯体疾病的患者。

仪器与试剂：甲醇和乙醇（色谱级）均购自默克公司。LC-MS/MS 购自美国GE 公司（Agilent7890A型），高速台式冷冻离心机购自湖南湘仪科学仪器设备有限公司（TGL-16 型）。

1.2 样本采集

所有入选者于前1 d 22：00 禁食，于第2 天清晨6：30 左右在安静状态下使用肝素钠真空采样管收集肘静脉血2～3 mL，4 ℃、3 000 r/min 离心10 min，取上层血浆组织。

1.3 液相色谱-串联质谱分析方法

取100 μL 样本并放入离心管，加入300 μL 甲醇溶液，混匀后12 000 r/min离心10 min。取375 μL上清液于5 mL 玻璃管中氮吹，吹干后加50 μL 甲氧胺吡啶（1 mg/mL）70 ℃水浴1 h。色谱柱从70 ℃开始升温，以8 ℃/min 的斜率上升到270 ℃。离子源温度280 ℃，接口温度230 ℃。

A 流动相：0.1%甲酸溶液；B 流动相：乙腈；进样量：4 μL；流速：0.4 mL/min；柱平衡时间：6 min。质谱条件采用电喷雾离子化，正离子模式：干燥气流速为11 L/min，碎片电压120 V，锥孔电压为60 V，干燥气温度350 ℃，八级杆电压750 V；负离子模式：干燥气流速为11 L/min，干燥气温度为350 ℃，锥孔电压60 V，碎片电压120 V。

1.4 统计学分析

本研究采用SPSS 19.00 统计软件进行统计学分析。计数资料以［n（%）］表示，对比采用卡方（χ2）检验。计量资料以（）表示，采用t检验，检验水准为α=0.05，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组研究对象基线资料比较

高血压组患者的性别、年龄、体质量、身高等与健康组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组研究对象基线资料比较［n=78，n（%），］

表1 两组研究对象基线资料比较［n=78，n（%），］

2.2 液相色谱-串联质谱分析法效果

LC-MS/MS 正、负离子模式下的总离子流图如图1 所示，具有很好的去噪性、匹配性、归一化等特性，也体现出良好的聚集情况，分析系统稳定性良好。

图1 正、负离子模式下两组的LC-MS/MS 效果比较

2.3 血浆差异性标记物筛选

微生物群落偏最小二乘判别分析（PLS-DA）显示正、负离子模式下散点图见图2，两组区分明显。

图2 微生物群落偏最小二乘判别分析显示正、负离子模式下散点图

2.4 血浆标志物的发现

血浆标志物在健康组和高血压组的峰面积经归一化后见表2。2-羟基丁酸、肌醇、9，12-十八碳二烯酸、十六酸、d-葡萄糖为高血压患者的血浆主要标记物，其出峰时间分别为10.22 s、8.21 s、8.11 s、10.57 s、9.22 s。

表2 两组研究对象血浆标志物的峰面积对比［n=78，］

表2 两组研究对象血浆标志物的峰面积对比［n=78，］

3 讨论

高血压患者虽然在居民中的发病率很高，但是准确的发病机制至今无法准确把握。而且该病的发生与发展受很多隐性危险因子、环境、基因等因素的影响［11］。高血压在长期发病过程中容易进展为心血管疾病，从而严重影响患者的预后［12］。

代谢组学属于系统生物学，采用高通量检测与数据处理为主要手段，以组群指标的检测和分析为基础［13］。当前代谢组学已广泛应用肝炎、冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）、肺癌、慢性肾病等疾病的分析，也已经取得了很好的效果［14-15］。代谢组学的研究样本可以是脑脊液、血液、尿液、唾液等，也可以是肌肉、头发、皮肤等组织。而高血压的发生是机体与遗传、环境因素之间交互作用的结果，也为代谢组学识别该病的发生提供了基础［16］。传统色谱法对样本的处理比较快速，对待测样本没有破坏性，但是检查的灵敏度和分辨率都比较低，也使得低含量的标志物无法检测［17］。LC-MS/MS 具有较高的分辨率和灵敏度，可应用于检测小分子与易挥发化合物，可对目标标记物进行准确的定性分析［18］。本研究显示LC-MS/MS 正、负离子模式下的总离子流图具有良好的去噪性、匹配性、归一化等特性，也体现出良好的聚集情况，分析系统稳定性良好。微生物群落偏最小二乘判别分析显示正、负离子模式下两组散点图区分明显。表明该方法具有潜在信息的强大挖掘能力，提高了分离效率和扫描速度，有利于对已知的和未知的标记物进行模式判断分析。

高血压患者多伴随有高血脂、高血糖风险，也可对活性氧类平衡产生影响［19］。不过该病的确切发病机制迄今仍不明确，代谢组学分析发现了一些血浆标记物和通路，有可能成为研究高血压发病机制的突破［20-21］。本研究LC-MS/MS 分析显示2-羟基丁酸、肌醇、9，12-十八碳二烯酸、十六酸、d-葡萄糖为高血压患者的血浆主要标记物。从机制上分析，葡萄糖是人体能量供应的来源之一，一旦发生胰岛素抵抗，葡萄糖就不能进入细胞，可导致d-葡萄糖的大量形成［22］。2-羟基丁酸、肌醇是葡萄糖耐受性不佳、妊娠高血压等疾病的生物标记物，特别是2 羟基丁酸是胰岛素抵抗和血糖调节受损等疾病的生物标记物［23］。9，12-十八碳二烯酸、十六酸是血脂代谢异常的标志物，脂肪组织中的酸循环过度利用也会导致胰岛素抵抗，影响胰岛素的正常工作，导致9，12-十八碳二烯酸、十六酸分泌增加［24］。另外，一旦胰岛素发生抵抗，肌醇在此糖代谢传递过程中利用率下降，从而可在血液中表达升高［25-26］。本研究也存在一定的不足，没有对患者疾病特征、种族地域进行深分析，且样本量较少，将在后续研究中深入探讨。

总之，本研究认为基于LC-MS/MS 的代谢组学研究方法可用于高血压血浆标记物质量浓度的测定，可为高血压发病机制、早期诊治提供线索和依据。