基于核桃油的中长链甘油三酯的酶法制备及纯化

邹孝强，高 盼，徐林海，张四红，何东平

(1.江南大学 食品学院，国家功能食品工程技术研究中心，粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 214122； 2.武汉轻工大学 食品科学与工程学院，大宗粮油精深加工教育部重点实验室，武汉 430023)

中长链甘油三酯(MLCT)是一类在甘油骨架上同时包含中链脂肪酸(MCFA)和长链脂肪酸(LCFA)的结构脂。MLCT作为一种特殊的功能性油脂，一方面利用中链脂肪酸提供即时能量[1-2]，另一方面利用长链脂肪酸提供营养[3-4]。因此，反应基料油的脂肪酸组成对于MLCT的营养价值具有重要意义。但是，目前大部分研究主要关注MLCT的功能性，忽略其营养性，缺乏对MLCT生产的基料油的筛选。就脂肪酸组成而言，核桃油作为一种重要的木本油脂，不饱和脂肪酸含量高达90%以上，亚油酸含量为51.2%～68.9%，α-亚麻酸含量为6.82%～15.01%，其ω-6/ω-3脂肪酸比例在世界卫生组织推荐摄入的比例范围之内(5∶1～10∶1)，是补充ω-6和ω-3脂肪酸的良好油脂来源[5]。因此，以核桃油为基料油生产MLCT对于提升其营养价值具有重要意义。

目前，文献报道合成MLCT的方法主要有酯交换法[6-7]、酸解法[8-9]等。其中，采用中链甘油三酯(MCT)与食用油脂直接进行反应获得MLCT的酯交换法，因其工艺过程简单易行，被广泛应用于工业生产中。但是，该方法制备的产物中含有一定量的MCT和长链甘油三酯(LCT)，MLCT含量相对较低。MCT消化及吸收速率过快，容易在小肠管腔造成较高的渗透压，大量食用可能会造成腹泻、呕吐、腹胀等肠胃不适症状[10]。因此，在合成MLCT反应后需要通过一定方法脱除体系中的MCT。

本研究利用脂肪酶催化MCT与核桃油进行酯交换反应，将核桃油转化为富含亚油酸与亚麻酸的MLCT，通过分子蒸馏脱除游离脂肪酸后，利用MCT与MLCT、LCT极性的差异，采用乙醇萃取酯交换产物中的MCT，降低产物中MCT的含量，从而获得高MLCT含量的产品。

1 材料与方法

1.1 实验材料

核桃油，重庆市九重山实业有限公司提供，脂肪酸组成与分布如表1所示；辛癸酸甘油三酯(MCT)，浙江建德千岛化工有限公司，脂肪酸组成与分布如表2所示；脂肪酶NS40086(酶活275 IUN/g)、Novozym 435(酶活10 000 PLU/g)、Lipozyme RM IM(酶活275 IUN/g)，诺维信(中国) 投资有限公司；Supelco 37种脂肪酸甲酯混标，Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司；TLC硅胶板60G(10 cm×20 cm)，烟台江友硅胶有限公司；色谱纯正己烷、乙腈、异丙醇、甲醇、1 mol/L烯丙基溴化镁溶液，百灵威科技有限公司(上海)；浓盐酸、冰醋酸、硼酸，分析纯。

表1 核桃油的脂肪酸组成与分布 %

表2 MCT的脂肪酸组成与分布 %

GC-14B气相色谱仪，日本岛津公司；Waters高效液相色谱仪，美国Waters公司；JJ-1B强力恒速搅拌器；GT16-3高速台式离心机；AR2140电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；HH-4数显恒温水浴锅；DL-180A超声波清洗仪；R-501低压旋转蒸发器；定时恒温磁力搅拌反应器；KDL1短程分子蒸馏设备，德国UIC公司；MixPlus 旋涡振荡器。

1.2 实验方法

1.2.1 MLCT的制备

将MCT与核桃油以一定摩尔比混合，向其中加入一定量(以底物质量计)的脂肪酶，充氮，并在一定温度下，转速600 r/min的条件下反应一定时间，得到反应产物。

1.2.2 分子蒸馏脱除游离脂肪酸

采用分子蒸馏除去反应体系中的游离脂肪酸。分子蒸馏条件：蒸发器温度185℃，冷凝器温度40℃，换热器温度60℃，旋转刮膜速率120 r/min，进料速度2 mL/min，绝对压力2 Pa。蒸发器的加热源来自于夹套中循环的加热硅油。

1.2.3 乙醇萃取纯化MLCT

向分子蒸馏重相中添加一定量的乙醇溶液，充分搅拌、振荡并离心，取出油相，采用低压蒸馏脱除乙醇，获得脱除MCT的结构脂产品。

1.2.4 反相高效液相色谱分析结构脂TAG组成

采用配备有蒸发光散射检测器(ELSD)的反相高效液相色谱分析结构脂TAG组成。分析条件：ELSD温度55℃，氮气(雾化气)流速1.8 mL/min，增益1；Lichrospher C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相为乙腈和异丙醇，流速0.8 mL/min，洗脱程序为30 min内将乙腈从70%降至60%，再在10 min内将乙腈降至55%，保持20 min，最后在5 min内将其升高至70%；进样质量浓度20 mg/mL，进样量10 μL。

1.2.5 脂肪酸组成分析

采用配备火焰离子化检测器的GC-14B气相色谱仪分析脂肪酸组成。气相色谱条件：PEG-20M熔融石英毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.5 μm)；柱升温程序为初温100℃，保留4 min，以15℃/min升温至180℃，保留4 min，再以4℃/min升温至215℃；进样口温度及检测器温度均为250℃。

1.2.6 TLC薄板分离TAG

从反应体系中取出50 μL样品，采用TLC薄板分离纯化得到TAG，展开剂为正己烷-乙醚-乙酸(体积比80∶20∶1)。分离结束后，在薄板上均匀喷洒0.2%的2,7-二氯荧光素的甲醇溶液并进行紫外显色。将TAG条带刮下，并用2 mL乙醚萃取两次，用无水硫酸钠干燥，并用氮气吹扫除去乙醚。加入50 μL 2 mol/L甲醇氢氧化钾溶液甲酯化反应3 min，再用2 mL正己烷萃取脂肪酸甲酯两次，用无水硫酸钠干燥，最后使用氮气浓缩，进气相色谱仪按1.2.5方法进行脂肪酸组成分析。

1.2.7 sn-2脂肪酸组成分析

将30 mg样品溶解于10 mL乙醚中，添加0.3 mL烯丙基溴化镁，剧烈搅拌1 min后，加入8 mL酸缓冲液(0.27 mol/L HCl溶于 0.4 mol/L硼酸)终止反应[11]。除去水相，将乙醚萃取液用硼酸洗涤两次，并用无水硫酸钠干燥。采用氮气将乙醚相浓缩至150 μL，以氯仿-丙酮(体积比90∶10)为展开剂，在硼酸浸渍的TLC板上分离。将sn-2 MAG条带刮下，并用2 mL乙醚萃取两次。用无水硫酸钠干燥，并采用氮气浓缩，最后按1.2.6方法对残余物进行甲酯化后，进气相色谱按1.2.5方法分析脂肪酸组成。

1.2.8 数据处理

所有实验均重复3次，结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与讨论

2.1 酶催化酯交换反应条件的优化

2.1.1 脂肪酶种类的影响

脂肪酶作为催化剂影响酯交换反应的因素主要有两个：一是酶的活力，二是酶的选择性。脂肪酶的活力影响酯交换反应的速率，即达到反应平衡所需的时间，酶的选择性影响反应产物的组成。在加酶量8%、反应时间9 h、MCT与核桃油摩尔比1∶1、反应温度55℃条件下，选择3种常用的商业性脂肪酶Novozym 435、NS40086、Lipozyme RM IM研究脂肪酶种类对酯交换反应的影响，结果如图1所示。

图1 脂肪酶种类对酯交换反应产物组成的影响

由图1可以看出，相对于其他两种脂肪酶，Novozym 435催化的反应产物中MLCT的含量最高，达到65.4%，同时反应产物中所含的LCT及MCT含量也最低。原因可能是，一方面Novozym 435对于此反应体系的活力较高，另一方面Novozym 435是一种非位置选择性脂肪酶，在反应过程中可以作用于TAG的3个位置，因此TAG 3个位置上的脂肪酸均参与反应，从而可获得较高的MLCT含量；而NS40086和 Lipozyme RM IM为sn-1,3位选择性脂肪酶，反应过程中仅作用于TAG的sn-1,3位脂肪酸，从而导致产物中MLCT含量相对较低，而LCT和MCT含量相对较高。因此，选择Novozym 435作为催化用酶。

2.1.2 MCT与核桃油摩尔比的影响

在反应过程中LCT既是反应原料，也是反应产物，因此反应产物中不可避免有一定含量的LCT。但是，根据酯交换反应脂肪酸平衡分布理论可推测，越高的MCT与核桃油摩尔比，有利于反应向生成MLCT方向进行，且最终产物中LCT含量越低；而过量的MCT可通过一定浓度乙醇进行分离。因此，考虑高MCT与核桃油摩尔比进行反应，同时采用MLCT/(MLCT+LCT)值作为反应优化的一个指标。在加酶量8%、反应温度55℃条件下，研究MCT与核桃油摩尔比对酯交换反应的影响，结果如图2所示。

由图2可以看出，MCT与核桃油摩尔比越高反应产物中MCT含量越高，而LCT含量越低。但对于MLCT而言，当反应时间短于3 h，产物中MLCT的含量随着MCT与核桃油摩尔比的升高而升高，但当反应时间超过3 h，MCT与核桃油摩尔比为2∶1的反应产物中MLCT的含量最高，直到反应达到平衡。原因可能是反应产物中MLCT含量是以反应产物中总TAG含量为基数进行计算的，反应物中MCT含量越高，反应产物中剩余的MCT含量也越高，影响体系中MLCT含量。通过比较MLCT/(MLCT+LCT)值发现，MCT与核桃油摩尔比越高，反应产物中MLCT/(MLCT+LCT)值越高。原因是越高的MCT与核桃油摩尔比，参与反应的MCT含量也越高，反应达到平衡后，LCT含量也越低，最终MLCT/(MLCT+LCT)值越高。但是，由图2可知，当MCT与核桃油摩尔比由1∶1增加至2∶1时，MLCT/(MLCT+LCT)值增加较快，但当MCT与核桃油摩尔比大于2∶1时，MLCT/(MLCT+LCT)值增加速率较慢。因此，选择MCT与核桃油摩尔比为2∶1。

2.1.3 加酶量的影响

在MCT与核桃油摩尔比2∶1、反应温度55℃条件下，研究加酶量对酯交换反应的影响，结果如图3所示。

由图3可以看出，随着加酶量的增加，在不同反应时间下，反应体系中MCT含量和LCT含量逐渐降低，MLCT含量逐渐升高。但是，当加酶量由6%增加至10%时，MLCT的增加量较高，而LCT降低量也较高，当加酶量由10%增加至12%时，两者变化幅度不大。不同加酶量下不同时间点MLCT/(MLCT+LCT)值与MLCT和LCT的变化类似，当加酶量由6%增加至10%时，MLCT/(MLCT+LCT)值增加较快，而当加酶量由10%增加至12%时，MLCT/(MLCT+LCT)值变化不大。因此，选择加酶量为10%。

2.1.4 反应温度的影响

本反应体系中，由于MCT与核桃油的极性差异影响了两种油脂的相容性，而较高的温度能够增加MCT与核桃油的相容性，从而提高反应效率。另外，温度影响酶的活力，合适的反应温度下，酶具有较好的活力，但较高的反应温度将会导致酶不可逆失活。在MCT与核桃油摩尔比2∶1、加酶量10%条件下，研究反应温度对酯交换反应的影响，结果如图4所示。

由图4可以看出，随着反应温度的升高，在不同反应时间下，体系中MCT含量与LCT含量不断降低，而MLCT含量不断增加。但是，当反应温度由35℃升高至55℃时，体系中MCT、LCT降低量以及MLCT的增加量均较高，当温度由55℃升高至65℃时，体系中MCT、LCT降低量以及MLCT的增加量均较低。不同反应温度下不同反应时间点MLCT/(MLCT+LCT)值与MLCT含量的变化类似，当反应温度由35℃升高至55℃时，MLCT/(MLCT+LCT)值增加量较高，而当反应温度由55℃升高至65℃时，MLCT/(MLCT+LCT)值变化不大。因此，选择反应温度为55℃。

通过单因素实验，得到Novozym 435酶催化MCT与核桃油酯交换制备MLCT的优化条件：加酶量10%，MCT与核桃油摩尔比2∶1，反应温度55℃，反应时间9 h。在优化条件下反应并通过分子蒸馏脱除游离脂肪酸后，所得产品中MLCT含量为76.2%，MCT含量为14.3%，LCT含量为9.5%。

2.2 乙醇萃取条件的优化

2.2.1 乙醇体积分数的影响

由于MCT中脂肪酸碳链较短，极性相对较高，易溶于乙醇，但LCT中脂肪酸碳链较长，难溶于乙醇，因此可用乙醇作为LCT与MCT的分离溶剂。为改变产物中MCT、MLCT以及LCT在萃取溶液中的分布比例，以获得最高含量的MLCT以及最高的产品得率，实验通过向乙醇中添加不同比例的水来改变其极性。因此，以萃取产物中MLCT含量及产品得率为指标进行优化。在底物(分子蒸馏重相，下同)与乙醇溶液比例1∶1条件下，考察乙醇体积分数对萃取效果的影响，结果如图5所示。

图5 乙醇体积分数对萃取效果的影响

由图5可知，随着乙醇体积分数的降低，产品得率逐渐升高，而MLCT含量先增高后降低。当乙醇体积分数为85%时，MCT溶解量最高，有利于产物中MCT的脱除，最终使萃取产物中MLCT含量最大。因此，选择乙醇体积分数为85%。

2.2.2 底物与乙醇溶液比例的影响

乙醇溶液用量会影响萃取过程中各种成分在溶液中的含量，从而影响产品得率及萃取产物中MLCT含量。在乙醇体积分数85%的条件下，研究底物与乙醇溶液比例对萃取效果的影响，结果如图6所示。

由图6可知，随着乙醇溶液用量的增加，产品得率逐渐减小，而萃取产物中MLCT含量逐渐增加。当底物与乙醇溶液比例由1∶1增加至1∶3时，萃取产物中MLCT含量由83.1%增加至85.4%，但是当底物与乙醇溶液比例由1∶3增加至1∶9时，萃取产物中MLCT含量变化较小，但是产品得率降低幅度较大。因此，为获得相对较高的MLCT含量以及较高的产品得率，选择底物与乙醇溶液比例为1∶3。

图6 底物与乙醇溶液比例对萃取效果的影响

经过乙醇萃取，所得结构脂产品中MLCT含量为85.4%，MCT含量为3.7%，LCT含量为10.8%，产品得率为80.8%。

结构脂产品的脂肪酸组成及分布如表3所示。

表3 产品的脂肪酸组成及分布 %

由表3可知，产品中C18∶2与C18∶3的比值为5.8，在世界卫生组织推荐摄入的比例范围之内，中链脂肪酸含量为49.4%，对于消化缺陷患者而言，可提升脂肪的消化吸收效率，同时，产品中sn-2位C18∶2和C18∶3的总含量达到39.7%，有利于人体对两种必需脂肪酸的吸收和利用。

3 结 论

本研究利用脂肪酶催化MCT与核桃油的酯交换反应，利用分子蒸馏脱除产物中的游离脂肪酸，再用乙醇萃取获得高MLCT含量的结构脂产品。结果表明：最佳酶催化酯交换反应条件为以Novozym 435为催化用酶，加酶量10%、MCT与核桃油摩尔比2∶1、反应温度55℃、反应时间9 h，在此条件下反应并通过分子蒸馏脱除游离脂肪酸后，所得产物中MLCT含量为76.2%，MCT含量为14.3%，LCT含量为9.5%。最佳乙醇萃取条件为乙醇体积分数85%、底物与乙醇溶液比例1∶3，在此条件下所得结构脂产品中MLCT含量为85.4%，MCT含量为3.7%，LCT含量为10.8%，产品得率为80.8%。本产品MLCT含量高，富含亚油酸与亚麻酸，且两种脂肪酸的含量比值为5.8，比例合理，可作为消化系统缺陷患者补充必需脂肪酸的油脂来源。