原发性中枢神经系统淋巴瘤患者血清miR- 548b、miR- 21的表达及其对预后的预测价值

汤静，王雄，高庆飞

(湖北文理学院附属谷城医院 神经外科，湖北 襄阳 441700)

原发性中枢神经系统淋巴瘤(primary central nervous system lymphoma，PCNSL)是较少见的一种脑肿瘤，具有病程短、侵袭性强、恶性程度高的特点，好发于脑室、脑组织、脊髓、脑膜等部位，在原发颅内肿瘤中占比为1%～3%[1]。该病治疗难度较大，进展非常快，病程可能仅数月时间[2]。而PCNSL的治疗缺乏统一标准，即便采取手术、放疗、化疗等方式，总体效果仍不够理想[3]。如何尽早对PCNSL进行诊断并提出针对性治疗方案，仍是临床研究的难点。研究表明，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)与肿瘤细胞侵袭、凋亡、转移、增殖密切相关，在肿瘤疾病中具有调节作用[4]。熊艳等[5]研究指出miR- 548b可通过调控肿瘤转移相关蛋白- 2，抑制恶性胶质瘤细胞增殖，提示miR- 548b可能具有抗癌作用。李丽等[6]发现，黏膜相关淋巴样组织结外边缘区淋巴瘤组织中miR- 21呈过表达，对细胞增殖与凋亡有调节作用。上述研究提示miR- 548b、miR- 21表达可能与肿瘤发生有关，但现阶段临床尚未完全明确二者与PCNSL病理特征及预后的关系，故本研究对此进行探讨，以期为PCNSL的靶向治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择我院2013年5月至2019年5月收治的PCNSL患者84例为PCNSL组，同期于我院进行体检的65例健康志愿者为对照组。本研究方案获医院伦理委员会批准，两组研究对象基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。纳入标准：(1) PCNSL组：经病理诊断证实为PCNSL(均为B细胞淋巴瘤)，未见中枢神经系统以外的部位累及；MRI、CT等影像学检查提示无外周病变；年龄≥18岁；近3个月内无免疫抑制剂应用史；自愿签署同意书。(2) 对照组：同期体检的健康志愿者，无中枢神经系统病变；年龄≥18岁；近3个月内无免疫抑制剂应用史；自愿签署同意书。排除标准：患其他类型的原发性肿瘤；既往有器官移植术史；伴有其他部位淋巴瘤；既往有心、脑血管病史；肝、肾等重要脏器功能不全；患血液系统疾病。

表1 两组研究对象基线资料比较

1.2 方法

1.2.1 miR- 548b、miR- 21检测 PCNSL组于入院第1天采血，对照组在体检当日采血。采集空腹肘静脉血3 ml，3 000 r·min-1离心10 min，分离血清，保存至-80 ℃备用。经实时逆转录聚合酶链反应(quantitative real- time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT- PCR)检测血清miR- 548b、miR- 21表达水平。主要仪器为7900HT型荧光定量PCR仪(美国Thermo Fisher公司)、Mx3005P型PCR扩增仪(美国Stratagene公司)、AVANTIJ- 15型高速离心机(美国Beckman公司)。主要试剂为逆转录试剂、Trizol试剂、PCR试剂、异丙醇、氯仿、琼脂糖，购自美国Invitrogen生命技术公司。根据Trizol试剂说明书对总RNA进行提取，检测其纯度与浓度，并按照逆转录试剂行逆转录，合成cDNA，通过荧光PCR仪测定目的基因表达量。引物序列：miR- 548b上、下游序列分别为5′- GCTAGTCCTGACTCAGCCAGT- 3′、5′- GTGCCAGCTGCAGTGGGGGAG- 3′，miR- 21上、下游序列分别为5′- GTGCAGGGTCCGAGGT- 3′、5′- GCCGCTAGCTTATCAGACTGATGT- 3′，内参引物U6上、下游序列分别为5′- CTCGCTTCGGCAGCACA- 3′、5′- AACGCTTCACGAATTTGCGT- 3′。反应条件：95 ℃ 10 min预变性；95 ℃ 15 s变性，60 ℃退火、延伸60 s，40个循环。以2-ΔΔCt表示miR- 548b、miR- 21表达水平。

1.2.2 随访分析 随访36个月，记录患者3年累积生存率，随访期间根据医嘱进行复查。

1.3 统计学处理

采用SPSS 20.0软件行数据分析，分别以常数(百分比)、均数±标准差表示计数、计量资料，分别行χ2、独立样本t检验。通过log- rankχ2检验分析不同血清miR- 548b、miR- 21表达患者的生存情况，绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析二者评估预后的曲线下面积(area under curve，AUC)。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组血清miR- 548b、miR- 21表达水平比较

PCNSL组血清miR- 548b表达水平为0.87±0.21，低于对照组的1.56±0.48，PCNSL组血清miR- 21表达水平为3.99±0.76，高于对照组的1.21±0.45，两组间差异有统计学意义(分别t=11.804、t=26.145，均P<0.001)。

2.2 血清miR- 548b、miR- 21表达与PCNSL病理特征的关系

以PCNSL组血清miR- 548b表达均值为界，分成高表达组与低表达组，血清miR- 548b表达≥均值为高表达组，否则为低表达组。miR- 548b低表达组、miR- 21高表达组肿瘤数目≥2个、肿瘤大小≥3 cm、深部病变占比均高于miR- 548b高表达组、miR- 21低表达组(P<0.05)，见表2。

表2 血清miR- 548b、miR- 21表达与PCNSL病理特征的关系 例

2.3 不同miR- 548b、miR- 21表达患者的预后分析

miR- 548b高表达组3年累积生存率为56.52%，高于低表达组的28.95%(log- rankχ2=6.420，P=0.011)，见图1。miR- 21高表达组3年累积生存率为31.82%，低于低表达组的57.50%(log- rankχ2=5.607，P=0.018)，见图2。

图1 不同miR- 548b表达患者的累积生存率

图2 不同miR- 21表达患者的累积生存率

2.4 血清miR- 548b、miR- 21表达对PCNSL预后的评估价值分析

根据患者生存、死亡情况分成生存组(37例)与死亡组(47例)。生存组血清miR- 548b、miR- 21表达分别为0.98±0.10、3.55±0.32，死亡组分别为0.78±0.12、4.33±0.42。生存组血清miR- 548b表达高于死亡组，miR- 21表达低于死亡组(t=8.150、9.355，均P<0.001)。血清miR- 548b、miR- 21表达对预后的评估价值见表3。

表3 血清miR- 548b、miR- 21表达对PCNSL预后的评估价值

3 讨 论

PCNSL是一种较少见的恶性肿瘤，主要累及中枢神经系统，临床表现多样，包括视力或视野改变、肢体无力、颅内压增高等，恶变程度高，预后非常差[7]。该病现阶段的治疗方式包括化疗、放疗、手术、造血干细胞移植等，虽有一定效果，但患者远期总体生存率仍未见明显提升[8]。近年来研究提出，miRNA与弥漫大B细胞淋巴瘤的发生及进展有关，这种内源性非编码RNA对基因表达有调控作用，可调节与参与肿瘤细胞的凋亡、增殖以及分化过程，其异常表达甚至会影响疾病预后[9]。通过寻求与PCNSL相关的miRNA，可能对PCNSL病情评估及预后预测有重要意义。

有学者发现，miR- 548b- 3p可能通过抑制磷脂酰肌醇3- 激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol- 3- kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)信号通路，对癌细胞增殖进行抑制[10]。曹慧琴等[11]研究则提示淋巴瘤患者的血浆miR- 21表达上调，并认为其表达与淋巴瘤进展存在关联。这表明miR- 548b、miR- 21可能在淋巴瘤进展中发挥了调控作用，本研究通过分析发现PCNSL患者的血清miR- 548b表达下调以及miR- 21表达上调，提示二者表达异常与PCNSL有关。miR- 548b是miR- 548家族的一员，它可能通过激活AKT信号、调节细胞周期蛋白与基质金属蛋白酶发挥作用[12]。miR- 548b可能通过调节T- reg细胞、辅助性T细胞1/辅助性T细胞2，从而抑制肿瘤细胞的生长[13]。miR- 21在肿瘤进展中有重要的调节作用，它可以通过多种途径加速细胞增殖，例如其能作用于转化生长因子- β、P53蛋白等，参与癌症进展[14]。本研究显示，PCNSL患者血清miR- 548b、miR- 21表达与肿瘤数目、肿瘤直径以及深部病变有关。在本次纳入的miR- 548b、miR- 21两项指标中，miR- 548b在PCNSL中具有抗癌作用，而miR- 21则主要为促癌作用，miR- 548b表达下降以及miR- 21表达增高可能导致PCNSL进一步进展，促使肿瘤体积增大、数目增多，并侵袭深部组织，引起深部病变，导致肿瘤侵袭性增强。

如何改善PCNSL的预后一直是临床研究的重点与难点问题，寻求与PCNSL预后相关的miRNA，对改善预后有重要意义。在本研究中，低表达miR- 548b与高表达miR- 21会降低患者3年累积生存率，二者对预后评估有一定价值。miR- 548b可通过对转移肿瘤相关蛋白- 2进行抑制，在恶性胶质瘤中发挥抑癌功能，过表达的miR- 548b能阻断肿瘤增长途径[15]。miR- 21表达增高可通过调节磷酸酶和张力蛋白同源物表达参与淋巴瘤发生过程[16]。miR- 21可能通过发挥促癌基因作用，促进肿瘤进展，影响PCNSL预后。

本研究阐述了miR- 548b、miR- 21与PCNSL患者病理特征及预后的关系，证实二者异常表达对PCNSL病情影响较大，且容易导致预后不良，临床有望通过对二者进行检测预测PCNSL的预后。

综上所述，PCNSL患者血清miR- 548b表达下调且miR- 21表达上调，二者表达对PCNSL预后评估有一定价值。本研究也存在不足，例如因PCNSL属于较少见的肿瘤，再加上受研究时间限制，因而纳入样本较少，日后还需要扩大样本量进一步分析二者在PCNSL发生、进展中的作用机制。