实验室条件下探究二氯异氰尿酸钠对伪狂犬病病毒的杀灭效果

黄 忍，陈 明，成 静，向 磊，刘小兵，梁焕斌，肖 驰

（1.广东天农食品集团股份有限公司，广东 清远 511500；2.西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041）

消毒是猪场重要的生物安全措施之一。猪场常用的消毒方法有物理消毒法、化学消毒法和生物消毒法等，其中化学消毒法最为常用[1]。化学消毒剂的正确选择和使用是决定猪场消毒效果的关键，同时化学消毒剂的价格也直接影响到猪场的消毒频次。自2018年8月非洲猪瘟暴发以来，非洲猪瘟（African swine fever, ASF）给国内养猪业造成了巨大的经济损失[2]。现阶段还未研发出安全有效的疫苗和特效药，生物安全是现阶段防控非洲猪瘟最有效的手段[3]。消毒作为生物安全的重要环节，起到切断传播途径、消灭非洲猪瘟病毒的关键作用[4]。然而市场上的消毒药琳琅满目，其最终的消毒效果是否能达到要求，使用多大的剂量才能真正达到杀灭病毒效果是各大养殖户和企业比较困惑的事情。现阶段对于非洲猪瘟病毒的研究仅限于几个科研机构。因此为了了解消毒药对非洲猪瘟的杀灭效果，很多集团实验室衍生出了很多评估方法，如通过细菌试验和使用其他DNA病毒代替非洲猪瘟进行消毒评估试验等[4]，也能间接说明消毒药对非洲猪瘟的杀灭效果。鉴于此，本研究使用同类DNA病毒的伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）替代非洲猪瘟病毒进行消毒药的评估，以期筛选出有效的消毒剂。同时我们也对二氯异氰尿酸钠在多种条件下的杀毒效果进行评估，为帮助寻找消毒效果好且廉价的消毒药提供选择参考。

1 试验时间与地点

试验于2021年8月20日至10月28日在夹江天农食品有限公司实验室进行。

2 材料

2.1 毒株

伪狂犬病活疫苗Bartha-K61毒株，购自某生物制药有限公司。

2.2 试剂

过硫酸氢钾复合盐、二氯异氰尿酸钠（45%，以有效率计）、氯化钠，市购。

2.3 中和剂

根据参考文献[5]选用4%硫代硫酸钠生理盐水。

3 方法

3.1 过硫酸氢钾复合盐溶液、二氯异氰尿酸钠溶液对PRV核酸破坏能力的测定

使用生理盐水对伪狂犬病活疫苗进行稀释，同时配置1∶100、1∶200的过硫酸氢钾复合盐溶液和0.3%的二氯异氰尿酸钠溶液。在常温下分别将上述800 µL消毒液和100 µL稀释后的疫苗液涡旋混匀相互作用30 min、5 min；每个消毒剂浓度设置4个重复，后加入100 µL中和剂终止反应；提取病毒核酸，使用PCR进行PRV检测。对照组为800 µL生理盐水+100 µL伪狂犬病疫苗稀释液+100 µL中和剂。

3.2 不同浓度二氯异氰尿酸钠对PRV核酸破坏能力的测定

将二氯异氰尿酸钠配置成终浓度为0.08%、0.1%、0.3%、0.5%的溶液；分别取上述消毒液800 µL和100 µL稀释后的伪狂犬病疫苗在冷藏（8～10 ℃）条件下作用30 min、10 min、1 min，每个消毒剂设置4个重复，作用时间结束后立即加入100 µL中和剂终止反应。提取核酸，使用PCR进行PRV检测。对照组为800 µL生理盐水+100 µL病毒液+100 µL中和剂。

3.3 0.3%二氯异氰尿酸钠溶液在低温环境和无有机物条件下对PRV核酸的破坏效果

将二氯异氰尿酸钠配置成终浓度为含10%氯化钠的0.3%二氯异氰尿酸钠溶液。将配置好的消毒液提前放置于低温（-8～-9 ℃）冰柜中30 min预冷；同时将稀释好的伪狂犬病疫苗和终止液提前放置于8～10 ℃的冰箱中30 min预冷。取出各预冷样品，将800 µL消毒液和100 µL疫苗液混合均匀后，放置在低温（-8～-9 ℃）冰柜中作用20 min、10 min、5 min、1 min，每个作用时间设置4个重复，时间一到立即加入100 µL终止液终止反应，提取病毒核酸，进行PCR检测。

3.4 0.3%二氯异氰尿酸钠溶液在高有机物和低温条件下对PRV核酸的破坏效果

3.4.1 0.3%二氯异氰尿酸钠溶液在有血清存在的情况下对PRV核酸的破坏效果 将配置好的含10%氯化钠的消毒液提前放置低温（-8～-9 ℃）冰柜中30 min预冷；同时将稀释好的伪狂犬病疫苗、猪血清和终止液提前放置于8～10 ℃的冰箱中30 min预冷。在2 mL离心管中同时加入预冷后的600 µL消毒液、200 µL猪血清和100 µL病毒液，涡旋、震荡、离心后在低温（-8～-9 ℃）冰柜中分别作用20 min、10 min、5 min、1 min，每个作用时间设置4个重复，加入100 µL中和剂终止反应，提取病毒核酸，进行PCR检测。

3.4.2 0.3%二氯异氰尿酸钠溶液在有新鲜粪便存在的情况下对PRV核酸的破坏效果 将配置好的含10%氯化钠的消毒液提前放置低温（-8～-9 ℃）冰柜中30 min预冷；将稀释好的伪狂犬病疫苗、猪粪和终止液提前放置于8～10 ℃的冰箱中30 min预冷。在2 mL离心管中同时加入预冷后的800 µL消毒液、1 g猪粪便和100 µL病毒液，涡旋、震荡、离心后置于低温（-8～-9 ℃）冰柜中分别作用20 min、10 min、5 min、1 min，每个作用时间设置4个重复，加入100 µL终止液终止反应，提取病毒核酸，进行PCR检测。

4 结果

4.1 两种消毒药对PRV核酸破坏效果的测定结果

从试验结果看，在相同的条件下，终浓度为0.3%的二氯异氰尿酸钠溶液对PRV核酸的破坏作用优于过硫酸氢钾复合盐溶液。结果见表1。

表1 消毒药与病毒作用后核酸PCR结果

4.2 不同浓度二氯异氰尿酸钠对PRV核酸破坏效果的测定结果

由表2可知，0.3%的二氯异氰尿酸钠溶液与PRV反应后，核酸PCR结果CT值为0，且浓度越高杀灭效果越好，而低于0.3%浓度的二氯异氰尿酸钠溶液仍能检测到CT值。

表2 不同浓度二氯异氰尿酸钠溶液与病毒作用后核酸PCR结果

4.3 0.3%二氯异氰尿酸钠溶液在无有机物环境下与PRV作用核酸PCR结果

由表3可知，0.3%二氯异氰尿酸钠溶液在低温且无有机物条件下与伪狂犬病疫苗作用1 min，可完全将病毒核酸破坏。

表3 与消毒液作用后PRV核酸PCR结果

4.4 0.3%二氯异氰尿酸钠溶液在高有机物条件下与PRV作用核酸PCR结果

由表4可知，0.3%二氯异氰尿酸钠溶液在有20%血清和低温（-8～-9 ℃）条件下与伪狂犬病疫苗作用20 min可完全将病毒核酸破坏。由表5可知，0.3%二氯异氰尿酸钠溶液在有1 g粪便和低温（-8～-9 ℃）条件下与伪狂犬病疫苗作用10 min可完全将病毒核酸破坏。

表4 二氯异氰尿酸钠溶液、疫苗液和血清三者混合作用下PRV核酸PCR结果

表5 二氯异氰尿酸钠溶液、疫苗液和粪便三者混合作用下PRV核酸PCR结果

5 讨论

本试验通过PCR检测方法，探讨了两种消毒剂对PRV核酸的破坏作用，通过试验最终确定了终浓度为0.3%二氯异氰尿酸钠溶液对PRV核酸的破坏作用更强；同时开展了0.3%二氯异氰尿酸钠溶液在无有机物和高有机物条件下对病毒核酸破坏效果的试验。试验结果显示，在无有机物条件下0.3%二氯异氰尿酸钠溶液在1 min可完全破坏病毒的核酸，而在有20%血清情况下需要20 min才能完全破坏病毒核酸，在有1 g新鲜粪便情况下需要10 min就能完全破坏病毒核酸。本研究还考虑到了低温区域存在冰冻的现象，因此也评价了消毒药在低温（-8～-9 ℃）条件下对伪狂犬病核酸的破坏效果。

对于消毒药的评估有多种方法。徐振娜等[6]通过消毒液和H3N2猪流感病毒混合后感染鸡胚，并通过鸡胚的成活率来判定消毒液的消毒效果。肖琦等[7]将次氯酸分别和等量圆环病毒2型（PCV2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪细小病毒（PPV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）混合后作用一定时间，然后感染对应细胞，通过96孔板细胞病变来判定次氯酸消毒液的消毒效果。而在大多数的养猪企业中，还没有健全的实验室，在细胞培养和鸡胚培养等技术及相关操作上也不成熟。多数消毒药是先作用于病毒核酸外的物质，如蛋白和各类酶，最后才作用于病毒的核酸，破坏核酸。反过来思考，一旦病毒的核酸遭到破坏，那么病毒一定是已经灭活。本研究就是根据该思路进行试验设计。而且通过核酸来判定病毒是否灭活，对很多实验室来说是完全能够进行的。该方法能够简单、直观地判定病毒的灭活状态。

在养猪生产中，对于消毒剂的选择，我们多使用过硫酸氢钾复合盐、浓戊二醛溶液、过氧乙酸和烧碱等。针对二氯异氰尿酸钠溶液的使用报道相对较少，胡正华等[8]和崔玉杰等[9]探究了二氯异氰尿酸钠溶液对水中微生物的杀灭效果，并验证了二氯异氰尿酸钠溶液具有较好杀菌、消毒效果。本试验不仅验证了二氯异氰尿酸钠溶液和其他消毒液具有同等的杀病毒效果，还验证了在高有机物和低温条件下二氯异氰尿酸钠溶液还具有较强的破坏病毒核酸效果。