如何保证猪场实验室非洲猪瘟荧光PCR检测结果的准确性

于新友，李天芝

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.渤海先进技术研究院，山东 滨州 256600）

非洲猪瘟在我国已经暴发近3年零5个月了，病毒已经形成一定的污染面。猪场毒株流行呈现多元化态势，强毒株、天然弱毒变异株、弱毒疫苗株均有报道。一些新出现流行毒弱毒株甚至可以暂时与猪共存，与其他猪常见病发生混感。目前尚无疫苗预防，也无药物治疗，生物安全是防控非洲猪瘟的最有效方法。当前猪场主流的防非措施还是生物安全。然而所有的措施都是靠人去执行的，严格的措施是否能落地，要看各猪场的管理水平。

为精准防控非洲猪瘟，国家鼓励猪场实验室开展非洲猪瘟自检工作，非洲猪瘟病毒荧光PCR检测为猪场实验室常规检测项目[1]。猪场实验室要远离猪场，按要求做好分区管理，每个区域固定专用移液器、枪头、离心管、工作服等，严禁带出本区域[2]。荧光PCR检测这个非洲猪瘟发生前对大家陌生的词汇，迅速成为热门。很多人被逼半路出家，开展自救检测。荧光PCR检测是一种技术含量很高的工作，要想做好并不容易。为保证检测结果的准确性和可靠性，笔者结合自身工作对检测环节的一些常见问题进行总结，供猪场试验室人员参考。

1 核酸制备方式

一些检测单位受条件所限，选择核酸快提试剂，关于核酸提取国家无统一明确的规定。笔者认为保证检测结果准确，核酸提取最好采用商品化试剂盒，主要有柱式人工提取或磁珠法自动提取，各实验室可根据自身条件和样品数量选择。不同厂家的试剂盒核酸提取效果肯定不一样，价格差别也很大，要经过试验比对筛选，尽管这样也不能保证同厂家核酸提取试剂盒每批次的稳定性。核酸提取能对核酸富集和纯化，总体效果还是好于免核酸提取法，但也不能一概而论，对组织或血清样本应该不会影响最终结果的判定。以柱式提取法为例，科普一下怎样从病毒到核酸。一般是200 µL样品，经裂解、挂柱、洗涤、洗脱等几个步骤，最终核酸50 µL。柱式法对试验人员经验要求高，适合少量样本的高频次提取操作，影响因素多。磁珠法机器操作，自动化程度高，适合大量样本检测，但仪器试剂成本高。核酸提取时动作轻柔，可减少气溶胶的产生，防止样品间交叉污染。核酸提取后，所有耗材及液体均要置于含消毒液的自封袋中，封口包装，避免实验室核酸气溶胶污染。

2 检测试剂盒的选择

市场上非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒品种繁多、鱼龙混杂，价格差别大，有国产的和进口的，有合法文号的和没有合法文号的，养殖户选择困难。进口试剂盒检测结果一般较准确和可靠，但价格昂贵，不同猪场实验室应根据自己经费情况选择购买。国产试剂盒生产厂家较多，质量差别大，要根据国家相关政策要求，选用目前符合国家规定试剂盒开展非洲猪瘟自检项目。鉴于些有文号试剂盒检测效果并不理想，购买时可同业内人员沟通交流，选择口碑好的生产厂家的试剂盒。任何检测试剂盒都有检测极限，敏感性和特异性不能兼得，选择自己能把握的试剂盒。笔者曾试购买某款有文号产品3盒，敏感性确实不错，但无论怎么做都不能保证阴性对照成立。最后查阅大量资料，将其归结为探针时间久，降解后自发荧光。有些厂家的非洲猪瘟检测产品都不止一款，有的多达七八种，产品质量难免参差不齐，乱象丛生。有的厂家为满足不同的市场需求，开发不同敏感性产品。猪场实验室也可以购买多个厂家试剂盒，用自己检测的样品进行验证比对。新购买试剂盒时，试剂4 ℃融化，瞬时离心后，可根据自己检验量分装保存，为保证检测效果，试剂尽量减少冻融次数，首次检测前最好先验证阴性对照和阳性对照是否成立。

3 仪器和耗材的选择

市场上仪器价格差异大，50万的仪器和2万的仪器检测结果肯定不一样，笔者做过相关研究，仅改变仪器，同一样本检测CT竟然相差10以上，因此，猪场实验室在经费允许的情况下，最好购买性能优良、质量好的荧光PCR仪。为防止气溶胶污染，荧光PCR反应加样的枪头应选用细长、带滤芯的，枪头要与移液器匹配，防止移液不准确。PCR反应8联管可分为透明管和不透明管，0.1 mL和0.2 mL等不同类别，要与所购买的荧光PCR仪相匹配，不同批次的管和盖不能混用。PCR反应管的盖子一定要紧，否则一旦有阳性样本扩增，扩增反应液挥发，会导致实验室气溶胶污染风险。

4 注意操作细节

柱式法核酸提取时，管体标记清晰，最后一步，延长离心时间，去除残留酒精，防止干扰扩增反应。PCR反应加样在生物安全柜内进行，提前紫外灯照射30 min，物品有规律摆放，合理分区，净区在左边，污区在右边。废弃枪头打入带盖10% 84消毒液中，消毒液最好现用现配，最长使用时间不要超过3 d。加样操作时配戴手套，动作轻柔，防止气溶胶产生及模板吸入加样器内。加样时遵循从低浓度到高浓度的顺序，先加阴性对照，再加检测样品，最后加阳性对照。PCR反应管盖一定要盖紧，避免荧光物质外漏，瞬时离心混匀，避免气泡产生。加上后尽快上机扩增，防止探针淬灭[3]。每次试验设置阴性对照和阳性对照，必要时增加阴性对照数量，对不同操作节段进行监控，随机放于扩增样品中间，阳性对照不要用强阳性样本，尤其不要用强阳性质粒作阳性对照。PCR结束后PCR产物严禁开盖，以防气溶胶污染[4]。检测过程中用到的吸头、离心管、PCR反应管及时清理，严禁高压灭菌，可放置于10% 84消毒液瓶中，在远离实验室的地方弃掉。样品处理过程中用过的废弃枪头、离心管等潜在被污染物品，要高压处理，以防实验室人为散毒。试验结束后对实验室内所有地面及墙面等进行消毒，75%酒精空中喷雾，开启紫外灯照射4 h以上。

5 弱阳性样本检测问题

检测时经常碰到一些弱阳性样本在对照成立的情况下，检测结果时阴时阳的问题，严重困扰检测人员。出现这种现象的原因众多，首先病毒核酸含量低，存在一个取样概率问题即所谓的捞现象，核酸如水里的汤圆不是每次都取到，目前主流试剂盒最多核酸加入量不过5 μL。试剂盒研发敏感性判定标准为稀释至一定浓度样本重复检测20次，有19次检测阳性即为最低检测线，在其他所有条件都相同的条件下，低浓度样本时阴时阳结果就可以理解了，但也不能排除实验室气溶胶污染。新冠检测标准要求设置3份阴性对照，意思是可能存在1份阴性对照不成立的情况。建议非洲猪瘟实验室检测时也可以设置3份阴性对照。对于一些专家提到的非洲猪瘟荧光PCR检测50个循环，起跳即阳的说法笔者不认同。某些引物探针扩增后期有非特异性扩增现象，市面上尚无50个循环扩增程序的厂家，包括新冠荧光PCR检测试剂，原因值得思考。如果按此理论设定100个循环敏感性岂不更好，实际上每种试剂都有一定的扩增能力。

6 小结

鉴于诊断制品的特殊性，很难制定统一的检测标准及结果判定方法，试剂的稳定性受到保存运输等方面影响很难保证检测结果始终一致。试剂盒体系不一样、程序不一样、使用仪器不一样，会得到不一样的检测结果。此外，人员也是关键的，需要具备一定的专业素质，要有一定的理论知识，定期培训和考核，持证上岗[5]，专业的人干专业的事，否则出现问题根本不知道如何分析解决，只会机械式操作。实验室环境条件，是否有分区操作，这些所有的因素都会影响检测结果的准确性。