枣庄黑盖猪精液品质与睾丸组织学研究

陈 涛，朱晓东，孙厚伟，曾勇庆，陈 伟

（1.山东农业大学动物科技学院，山东 泰安 271018；2.枣庄黑盖猪养殖有限公司，山东 枣庄 277100）

枣庄黑盖猪是我国优良的地方猪种之一，具有性成熟和体成熟早、繁殖性能高、肉品质优良等特征，是典型的华北型猪种[1]。精液品质不仅是揭示精液受精能力的综合指标，而且严重影响着猪场的盈亏和猪群的扩繁速度。提高地方猪的精液品质有利于加快地方猪的扩群和遗传改良，以及提高受胎率。由于精子的生成受下丘脑-垂体-睾丸轴的调控，所以精子的生成离不开睾丸的发育，而睾丸生长随年龄的增加发生相关的生理变化[2]。

近年来，随着国家对地方猪种质资源的重视和非洲猪瘟对生猪产业的影响，地方猪的保种和开发利用迫在眉睫。本研究旨在通过对枣庄黑盖猪精液品质与生精小管组织学进行分析，揭示枣庄黑盖猪公猪繁殖性能的特点，为探究地方猪公种猪的遗传改良和合理利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验时间为2020年9月至11月底。试验地点为枣庄黑盖猪养殖有限公司。选取枣庄黑盖猪种公猪18头按年龄分为3组（6头/组），进行精液品质测定。

选取14日龄枣庄黑盖猪公猪（HG×HG）13头、80日龄枣庄黑盖猪公猪（HG×HG）6头和14日龄杜洛克公猪与枣庄黑盖猪母猪杂交的F1代公猪（D×HG）17头，进行保定后摘取左侧睾丸，用0.9%生理盐水清洗，然后放入组织固定液，最后置于4 ℃冰箱保存。

1.2 饲养管理

成年公猪均单栏饲养，自由饮水，半露天式圈舍，自然通风，每天饲喂两次。生长期公猪5头/栏，自由采食。免疫、保健和消毒水平均相同。

1.3 枣庄黑盖猪精液品质测定

经驯化后，多数公猪可以使用假台猪采集精液，部分公猪只能使用发情母猪作为台猪采精，公猪驯化期间放精两次，间隔5～7 d后进行试验，每头公猪采精3次，采精间隔均为3 d。在枣庄黑盖猪养殖有限公司兽医实验室进行测定，每份精液于10 min内完成测定。精液采集与精液品质测定方法同王黎等[3]所用的方法。

1.4 睾丸组织石蜡切片制作与形态学观察

睾丸组织经48 h固定后进行横切，修成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm的组织块；组织块经冲洗、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋后切片；石蜡组织切片经HE染色后使用中性树胶封片。

将睾丸组织切片在显微镜下用NIS-Element软件测量生精小管内径和界膜厚度并拍照。每个试验组选取横断面近似正圆的生精小管100个，按Makler评分法对生精小管内径、基膜厚度、管壁生殖细胞层数和生殖细胞成熟度评估，方法同韦思明[4]。

1.5 数据处理

利用SPSS Statistics 26软件对精液品质性状的试验数据进行单因素方差分析和显著性检验；采用GraphPad Prism 8软件对Makler评分进行t检验并做图；使用Photoshop CC 2019软件处理图片。所有数据以“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 枣庄黑盖猪精液品质分析

枣庄黑盖猪精液品质中的精子密度（图1A）、精子活力（图1B）和精子活率（图1C）随着年龄的增加呈降低趋势，这3个性状均以1～2岁组最高，极显著高于3～4岁组和5～6岁组。而精子畸形率以5～6岁组最高（35.83%），1～2岁组最低（10.50%），各组间呈极显著差异（图1D）。3～4岁组枣庄黑盖猪的pH（图1E）、采精量（图1F）和采精时间（图1G）极显著高于1～2岁组（P＜0.01），同样高于5～6岁组但差异不显著（P＞0.05）。精液的温度随年龄的增加呈上升趋势（图1H）。

图1 枣庄黑盖猪精液品质分析

2.2 精液品质各性状相关性分析

由表1可知，枣庄黑盖猪的精子活力与活率呈强度正相关，而二者与畸形率分别呈强度和中度负相关（P＜0.01）；精液温度与畸形率存在强度正相关，与活力和活率则存在中度负相关（P＜0.01）。此外，采精量与采精时间存在极强正相关，且二者均与精液pH存在强度正相关（P＜0.01）。

表1 枣庄黑盖猪精液品质各性状相关性

2.3 枣庄黑盖猪睾丸组织学和Makler评分分析

将HE染色后的组织切片置于显微镜下观察（40×），枣庄黑盖猪睾丸组织中曲细精管的生殖细胞层数（图2A）和内径（图2B）随着日龄增加而增加。80日龄枣庄黑盖猪公猪睾丸组织中生精小管内径（图2C）、界膜厚度（图2D）、管壁生殖细胞层数（图2E）、生殖细胞成熟度（图2F）和Makler评分（图2G）均高于14日龄枣庄黑盖猪（P＜0.01）。

图2 枣庄黑盖猪睾丸组织学（40×）和Makler评分分析

2.4 枣庄黑盖猪杂交后代睾丸组织学和生精小管Makler评分分析

将HE染色后的组织切片置于显微镜下观察（20×），在相同视野下14日龄的杜洛克公猪与枣庄黑盖猪母猪杂交的F1代公猪（图3A）的生精小管比14日龄枣庄黑盖猪公猪的排列更加紧密（图3B）；而且杜洛克公猪与枣庄黑盖猪母猪杂交的F1代公猪的生精小管内径（图3C）、管壁生殖细胞层数（图3D）和Makler评分（图3E）均显著高于枣庄黑盖猪（P＜0.05），但是界膜厚度和生殖细胞成熟度没有差异。

图3 不同父本间猪睾丸组织学（20×）和Makler评分分析

2.5 枣庄黑盖猪曲细精管生殖细胞发育分析

为探究80日龄枣庄黑盖猪曲细精管生殖细胞发育程度，对枣庄黑盖猪曲细精管腔内生殖细胞进行观察和分析，发现靠近基膜的精原细胞数量逐渐减少，多数曲细精管内形成管腔（图4A和图4B）；基膜至管腔间出现大量减数分裂Ⅰ期和减数分裂Ⅱ期精母细胞；延伸形态精子依附于基膜、支持细胞或游离于管腔附近，在靠近管腔处发现精子残余体和大量圆形精子（图4C），说明80日龄枣庄黑盖猪已进入初情期。

图4 枣庄黑盖猪曲细精管生殖细胞发育分析（40×）

3 讨论

3.1 年龄对枣庄黑盖猪精液品质的影响

地方猪养殖中的配种方式多以本交为主，较少使用人工授精进行扩繁，导致种公猪利用率和扩繁效率较低。公猪精液品质一般从1岁后开始升高，在2～3岁时精液品质达到最佳，然后在4岁以后开始下降；而后备公猪最初的精液中往往含有大量死精和畸形精子，导致其精液品质较差[3]。公猪睾丸温度升高会改变类固醇的生成，伴随着过度的热传递可能会影响精子结构完整性，导致射精量减少、精子活力下降、畸形精子数的增加[5]。精液品质虽然不会立即受到睾丸温度变化的影响，但会在热应激后两周开始下降，直到热应激结束8周后才恢复正常[6-8]。为减少热应激对精液品质的影响，本研究选择秋季进行试验，结果发现随着枣庄黑盖猪年龄的增长，精子密度、精子活力和精子活率均呈下降趋势，而精子畸形率和精液温度则呈上升趋势，说明枣庄黑盖猪精液品质受年龄影响较为显著；这是由于睾丸组织的生精功能发生了与年龄相关的组织学变化，导致射精量和精子活率的下降，从而影响精液品质[2]。因此，在枣庄黑盖猪的保种工作中，应加强对年轻公猪的饲养管理以提高核心群扩繁的效率；在夏季适当添加氨基酸和维生素以提高性欲并改善精液品质[9-10]。

3.2 日龄和父本对生精小管发育的影响

睾丸的组织学和生理学变化与年龄极为相关，尤其表现在精子产生和生殖激素功能的改变。年龄对睾丸组织学的影响在人类医学研究领域较为成熟，而对地方猪的研究有限[2，11]。本研究利用Makler评分系统评估了枣庄黑盖猪睾丸组织学变化，发现枣庄黑盖猪生精小管内径和管壁生殖细胞层数随着日龄的增加而增加。而相同日龄条件下，杜洛克公猪与枣庄黑盖猪母猪杂交的F1代公猪除界膜厚度和生殖细胞成熟度均高于纯种枣庄黑盖猪，说明前者具有一定的杂交优势，可能更早进入体成熟阶段[12]。通过对睾丸组织切片的HE染色进行生精上皮组织形态学分析，发现纯种枣庄黑盖猪生精小管在80日龄时出现管腔，并伴有少量精子产生，同时在切片中发现各级生殖细胞；枣庄黑盖猪与太湖猪相比，纯种枣庄黑盖猪在80日龄时生精小管直径为141.96 mm，大于120日龄太湖猪的122.64 mm[13-14]；综上结果表明，枣庄黑盖猪在80日龄达到初情期并具有一定的受精能力和早熟特性。

4 结论

本研究发现，从枣庄黑盖猪精子密度、精子活力和精子畸形率等方面综合考虑，枣庄黑盖育种核心群中的种公猪年龄结构应以1～2岁为主，可缩短育种群的世代间隔，加快遗传进展。此外，研究发现枣庄黑盖猪公猪的初情期较早，可为枣庄黑盖猪公猪繁殖性能及初情期的确定提供参考。