鸡粪模拟堆肥中多重耐药菌、耐药基因和整合酶基因的消减动力学解析

姜欣然，李 涛，孙兴滨，唐伟欣，王旭明，高浩泽，仇天雷*

1. 东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040

2. 北京市农林科学院生物技术研究所，农业基因资源与生物技术北京市重点实验室，北京 100097

由于抗生素在促生长、预防和治疗动物疾病方面具有良好的效果，所以长期以来被广泛用于集约化畜禽养殖业. 据统计，我国是主要的抗生素原料药生产和抗生素产品消费国之一，年产量超过100万吨，年消费量约为世界总量的12.5%. 兽用抗生素的长期使用直接导致畜禽粪便中抗生素耐药菌和耐药基因的大量残留. 耐药细菌随畜禽粪便排出后，其携带的耐药基因可以通过质粒、转座子、整合子等可移动元件传递给其他细菌，从而导致耐药基因的传播和扩散. 整合子是耐药基因传播的重要元件，可以通过整合酶基因位点不断从外部环境中整合一种或几种耐药基因盒，使细菌获得耐药性或多重耐药性. 吴聪明等研究发现，长期使用氨基糖苷类和磺胺类药物后，从猪粪中分离的菌株对多种抗生素表现出耐药性，同时检测到Ⅰ类整合酶基因中含有及基因盒. 魏秀丽等从山东地区肉鸡体内分离的多重耐药的大肠杆菌中也检测到+5基因盒. Vo等研究发现，从牛体内分离的沙门氏菌携带有和等基因盒，并对磺胺类及氯霉素类等药物表现出耐药性，说明整合子结构对养殖粪便中条件致病菌的多重耐药表型十分重要.

高温堆肥能够利用微生物的好氧发酵作用分解并稳定畜禽粪便中的有机物，形成腐植酸丰富的有机肥，是畜禽粪便无害化利用的常用技术. 目前研究表明，在畜禽粪便堆肥过程中，耐药基因的相对丰度变化与整合酶基因呈显著相关，堆肥后部分与Ⅰ类整合子-整合酶基因(，简称“Ⅰ类整合酶基因”)相关的耐药基因〔如磺胺类耐药基因()〕的丰度反而会出现增长. 然而目前多数研究关注的是堆肥过程中耐药基因和可移动元件的丰度变化及其相关性分析，而对于耐药基因消减动力学以及整合酶基因的影响研究较少. 因此，该研究通过在模拟堆肥中定量添加含有多重耐药整合子的大肠杆菌，利用选择平板计数、数字微滴PCR技术并结合非线性回归分析，获取多重耐药菌数量、Ⅰ类整合酶基因()及相关耐药基因(、)、非整合子耐药基因(和)的绝对丰度和相对丰度，及其在堆肥过程中的变化规律，并进一步分析两类耐药基因的消减动力学模型和半消减周期，以期为有效去除养殖源耐药菌以及可移动耐药基因提供基础数据.

1 材料与方法

1.1 样品的来源及采集

所用鸡粪取自北京市平谷区某蛋鸡养殖场，辅料为玉米秸秆粉. 采集粪便样品后，迅速带回实验室于4 ℃下保藏，在24 h内进行耐药菌的计数. 菌株为分离自养殖场粪便中的多重耐药大肠杆菌()菌株5A5.

1.2 堆肥试验设计

堆肥原料及配比：取800 g干鸡粪，按鸡粪与玉米秸秆粉(粒径1～3 cm)质量比(以干质量计)2.5∶1的比例进行混合，并搅拌均匀. 根据前期研究结果，鸡粪中多重耐药菌的浓度约为4.26×10CFU/g. 混匀后试验组加入10%菌体浓度为4.77×10CFU/g的5A5多重耐药菌悬液，空白组加入等体积蒸馏水，调整含水率至60%，初始C/N为15，搅拌混匀后分装三角瓶后置于水浴中，堆肥原料成分见表1.

表 1 堆肥原料成分Table 1 Components of raw manure and corn stalks

试验设计：堆肥试验于恒温水浴箱内进行，高温堆肥模拟设置试验组及空白组，每组3个重复. 采用水浴控制堆体温度，试验温度设置见图1. 每天搅拌混匀2次，曝气泵充氧5 min.

1.3 总菌、大肠杆菌计数及多重耐药菌计数

称取10 g模拟堆肥样品，倒入已灭菌的90 mL生理盐水三角瓶中，摇床振荡15 min使堆肥样品均匀分散，吸取悬浮液进行梯度稀释. 稀释液涂布对应培养基：细菌总数采用普通LB营养琼脂，大肠杆菌计数采用大肠杆菌显色培养基. 灭菌后的培养基中添加抗生素混合液，涂布后平板倒置于28 ℃恒温箱中，培养48 h，选取菌落数为30～300个的平板进行计数. 多重耐药抗生素种类为家禽养殖中常用的抗生素，抗生素名称及培养基终浓度分别为四环素(16 μg/mL)、恩诺沙星(1 μg/mL)、磺胺甲唑(76 μg/mL)、泰乐菌素(1 μg/mL)，抑菌浓度参考2011年美国临床实验室标准化协会(CLSI)规定值.

图 1 堆肥试验温度控制示意Fig.1 Temperature diagram of composting experiment

1.4 多重耐药菌耐药质粒鉴定及耐药基因定量检测

细菌质粒DNA提取及测序

使用QIAGEN Plasmid Mini Kit试剂盒提取5A5菌株的质粒DNA，经检测后送至诺禾致源公司进行基因测序.

在8 334张门急诊处方中，不合理处方50张，不合格率为0.6%。不合理处方点评结果（见表2，表3，表4）。

耐药基因引物设计与数字PCR定量检测

根据多重耐药菌5A5中质粒上携带的耐药基因测序序列，设计氨基糖苷类耐药基因()、磺胺类耐药基因()、粘杆菌素耐药基因()及喹诺酮耐药基因()对应的Taqman探针引物；并根据多重耐药菌株肠杆菌16S rRNA基因，设计特异性定量引物(见表2)，Ⅰ类整合酶基因()和细菌16S rRNA基因引物参照文献[11]. 数字微滴式PCR反 应在QX200 Droplet Digital PCR (ddPCR)Systems中完成，选用Trans PCR SuperMix. 反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；72 ℃延伸10 min.

表 2 菌株5A5引物名称及序列Table 2 Primer names and sequences of strain 5A5

1.5 数据统计分析

采用Excel 2016软件对试验数据进行处理后，根据时间与耐药基因丰度的变化，运用Origin 2019b软件中的非线性回归分析对试验数据进行拟合，使用的一级动力学反应方程如下：

式中：为时耐药基因的绝对丰度，copies/g；为堆肥开始时的耐药基因的绝对丰度，copies/g；为耐药基因消减速率常数，d.

2 结果与分析

2.1 耐药菌株的质粒获取及结构解析

将多重耐药菌株5A5提取的质粒进行二代测序分析，结果表明，5A5菌株质粒上携带有多种类型耐药基因及整合子(见表3)，包括及等12种耐药基因，以及Ⅰ类整合酶基因(). 这些耐药基因主要对头孢菌素、氨基糖苷类、磺胺类、二氨基嘧啶、多肽类、氟喹诺酮类、大环内酯类及氯霉素类8种常用抗生素具有耐药性. 而根据5A5菌株的抗生素药敏试验结果，该菌在头孢噻呋、头孢哌酮、氟苯尼考、氯霉素、环丙沙星、恩诺沙星、青霉素、庆大霉素、诺氟沙星、氨苄西林、红霉素、磺胺甲唑、左氧氟沙星等抗生素上均具有耐药性，结合基因型和表型分析结果，说明该菌耐药表型的获得与耐药质粒上携带的耐药基因直接相关.

表 3 菌株5A5中耐药基因及整合酶基因信息Table 3 ARGs and integrase gene on strain 5A5

氨基糖苷类、磺胺类、喹诺酮类抗生素是畜禽养殖过程中常规使用的抗生素，而大肠杆菌亦为家禽内优势的肠道微生物，由于该菌适合肠道环境并且在有抗生素选择压力的情况下，能够在家禽肠道中长期存在，其质粒上携带的多种抗生素耐药性可在不同种类细菌中转移和传播，具有较大的环境风险；大肠杆菌在人、动物体内和自然环境中广泛存在，是常见的条件性病原菌之一，具有接受、储备和传递耐药遗传因子的能力，常作为耐药水平的指示菌. 因此选择该菌作为模式菌株添加进入堆肥系统中，研究其质粒上多重耐药基因随堆肥过程发生的变化，以期获得高温堆肥对多重耐药菌及其耐药基因的消减规律，降低环境中由于畜禽养殖带来的多重耐药污染的传播风险.

2.2 高温堆肥过程中可培养耐药大肠杆菌及总菌数的变化

好氧堆肥的高温条件能够影响中温菌的生长，对大肠杆菌等条件致病菌具有有效的灭杀作用. 将不同堆肥时段(1、2、5、7、10 d)采集的样品分别进行大肠杆菌和总菌群计数，并同时在多重耐药平板上进行多重耐药大肠杆菌和总耐药菌计数(见表4).

表 4 堆肥过程中可培养耐药菌的计数结果Table 4 Counting results of cultivatable drug-resistant bacteria during composting

结果表明，无论常规还是多重耐药的大肠杆菌，高温堆肥对其都有良好的灭杀作用，堆肥5 d检测时，已无可培养的大肠杆菌被检出. 虽然接种了多重耐药大肠杆菌的试验组初期(第1、2天)大肠杆菌和多重耐药大肠杆菌均高于对照组，但第5天的样品中已检测不到大肠杆菌，该结果与前期单一耐药大肠杆菌结果相似，说明抗生素耐药的获得并不能改变大肠杆菌的耐热性能. 高温堆肥对中温细菌的抑制作用明显，与中温细菌总菌数相比，可培养的多重耐药菌对高温堆肥更为敏感，从堆肥初始(第1、2天)到第10天，可培养的多重耐药菌总数降低了4～6个数量级，而总菌数仅降低了3个数量级.

2.3 高温堆肥过程中耐药基因丰度的变化

图 2 高温堆肥过程中16S rRNA和整合酶基因绝对丰度的变化Fig.2 Absolute abundance of 16S rRNA and integrase genes during composting

图 3 高温堆肥过程中耐药基因绝对丰度的变化Fig.3 Absolute abundance of drug-resistant genes during composting

基因的绝对丰度表征每克堆肥样品中该基因的绝对拷贝量，16S rRNA基因的绝对丰度代表环境中细菌总量，基因的绝对丰度代表环境中Ⅰ类整合酶基因的数量. 结果(见图2)表明，在连续的30 d堆肥过程中，16S rRNA基因和Ⅰ类整合酶基因的绝对丰度逐渐降低，这与可培养的耐药菌数量变化趋势相一致. 其中，代表总菌的细菌16S rRNA基因绝对丰度最高，在10～10copies/g之间；代表大肠杆菌的肠杆菌16S rRNA基因绝对丰度最低，在10～10copies/g之间；而基因的绝对丰度在10～10copies/g之间. 到堆肥第30天，肠杆菌16S rRNA基因的绝对丰度从最初的5.37×10copies/g逐渐降至1.50×10copies/g，其消减率为97.15%；基因的绝对丰度从最初的3.95×10copies/g逐渐降至7.55×10copies/g，消减率为80.89%.

在、、及这4种耐药基因中，和两个耐药基因和Ⅰ类整合酶基因的绝对丰度变化趋势相同(见图3). 由于耐药基因在鸡粪原料中并未被检出，随着高温堆肥过程的进行，外源宿主菌5A5被高温杀死，所以其上携带的耐药基因呈明显降低趋势. 由于和基因在鸡粪原料中有大量检出，所以基因绝对丰度较高，堆肥过程其数值变化范围在10～10copies/g之间. 到堆肥第30天，基因的绝对丰度从初始的2.42×10copies/g降 至2.57×10copies/g，消 减 率 为89.39%；基因的绝对丰度也从初始的4.71×10copies/g降至9.46×10copies/g，消减率为97.99%；基因的绝对丰度则从1.97×10copies/g降至2.09×10copies/g，消减率为99.89%；基因的绝对丰度从2.22×10copies/g降 至4.22×10copies/g，消 减 率 为99.81%. 由此可以看出，连续高温的堆肥过程对Ⅰ类整合酶基因或是耐药基因都有着较好的消减效果，而位于整合子基因盒上的耐药基因(和)的消减效率低于不与整合子相连的耐药基因(和).

相对丰度是将绝对丰度进行归一化处理，即每16S rRNA拷贝数对应的特定基因拷贝数，表征该环境下微生物群落中该基因的相对丰度. 耐药基因的相对丰度通常表征菌群中相应耐药水平的高低. 堆肥过程中，耐药基因及Ⅰ类整合酶基因的相对丰度和削减率的关系如图4所示，可以看出，肠杆菌16S rRNA、、及基因的相对丰度在堆肥过程中均先降低，然后在15～30 d内有小幅上升，而、这两个基因的相对丰度均随堆肥时间的增加而持续降低. 经过高温堆肥后，整合子中基因的相对丰度从0.26降至0.03；耐药基因的相对丰度从0.17降至0.02；的相对丰度从0.30降至0.008；而耐药基因、的相对丰度均下降了3个数量级. 肠杆菌16S rRNA、、、基因的削减率分别为95.61%、87.08%、86.37%、97.25%，而、基因的削减率则分别达到99.89 %和99.79 %. Liao等研究表明，虽然高温堆肥能够消除一部分初始微生物，但是很多ARGs保留在幸存的微生物群落中，推测堆肥过程中发生了水平基因转移，因而传统堆肥方式并不能有效去除ARGs和MGEs.Lin等研究表明，堆肥并不能有效控制磺胺类抗性基因向耐热菌群(如)中转移. 这些研究都说明和基因可能通过基因水平转移到耐高温的菌群中而得以存活.

图 4 高温堆肥过程中16S rRNA基因、整合酶基因和耐药基因相对丰度的变化Fig.4 Relative abundance of 16S rRNA, integrase genes and drug-resistant genes during composting

2.4 耐药基因的消减动力学分析

以绝对丰度和堆肥时间数据为基础，进行堆肥过程中耐药基因绝对丰度消减曲线拟合，对比拟合曲线的决定系数()(见表5)发现：①添加多重耐药菌可以有效模拟外源耐药基因污染的消减情况，如耐药基因的试验组拟合曲线的为0.999，而对照组未检出基因；耐药基因的试验组拟合曲线的为0.998，而对照组的偏低，为0.788. ②养殖环境中广泛存在的耐药基因、在试验组和对照组中的消减规律类似，耐药基因的试验组拟合曲线的为0.961，对照组为0.972；耐药基因的试验组拟合曲线的为0.924，对照组为0.937；总细菌16S rRNA基因消减曲线的无论是试验组还是对照组都偏低，分别为0.833和0.695，主要原因是，堆肥高温过程除中温菌受抑制外，高温菌数量会有所提升，导致总细菌的消减规律并不符合一级动力学方程；而肠杆菌科特异16S rRNA基因，无论是试验组和对照组均符合一级动力学方程，说明堆肥过程能有效处理养殖粪便中的大肠杆菌.

试验组基因绝对丰度的消减速率从快到慢分别为喹诺酮类耐药基因、多肽类耐药基因、磺胺类耐药基因、肠杆菌16S rRNA基因、氨基糖苷类耐药基因、整合酶基因. 由于基因是Ⅰ类整合酶基因盒内耐药基因，所以和基因的消减速率常数和半消减期较为相似，基因的消减速率常数为0.119 d，半消减期为5.81 d，而基因的消减速率常数为0.103 d，半消减期为6.71 d.基因的消减速率常数为0.243 d，半消减期为2.86 d；基因的消减速率常数为0.391 d，半消减期为1.77 d；基因的消减速率常数为0.411 d，半消减期为1.69 d. 肠杆菌16S rRNA基因的消减速率常数为0.128 d，半消减期为5.41 d，说明相对于可培养大肠杆菌在堆肥第5天即完全失活而言，肠杆菌的DNA存活时间要更长(见图5).

对照组基因绝对丰度曲线拟合结果与试验组基本一致，但由于粪便中耐药基因、绝对丰度较低，二者在对照组中的消减规律并不符合一级动力学方程. 从堆肥第2天到第15天，对照组中基因的消减速率常数为0.155 d，半消减期为4.48 d；基因的消减速率常数为0.148 d，半消减期为4.68 d；基因的消减速率常数为0.265 d，半消减期为2.61 d；肠杆菌16S rRNA基因的消减速率常数为0.173 d，半消减期为4 d(见图6). 总体来说，对照组耐药基因的半消减期均略低于试验组，说明耐药基因的绝对丰度越高，其消减周期越长.

基于耐药基因相对丰度和堆肥时间数据，进行堆肥过程中耐药基因相对丰度消减曲线拟合，发现各耐药基因相对丰度的消减速率普遍低于其绝对丰度的消减速率，如基因相对丰度的消减速率常数为0.192 d，半消减期为3.61 d，基因相对丰度的消减速率常数为0.284 d，半消减期为2.44 d，皆明显低于相应的绝对丰度消减速率. 试验组基因的相对丰度消减拟合曲线的仅为0.876，说明基因相对丰度的消减规律并不符合一级动力学模型.而、基因的相对丰度拟合曲线的分别达到0.984、0.999，说明“独立”耐药基因的消减规律符合一级动力学模型. 相对丰度数值实际是绝对丰度与16S rRNA基因绝对丰度的比值，如果符合一级动力学模型，即表明堆肥使得含有耐药基因的比例能以稳定速率减少，即可以通过延长堆肥时间来有效减少该耐药基因在堆肥中的相对丰度. 相反，相对丰度消减规律不符合一级动力学模型，说明该耐药基因(如)相对丰度的消减速率并不稳定，需要进一步分析其影响因素.

表 5 堆肥中耐药基因绝对丰度(C)的消减速率和半消减期Table 5 Dissipation rate and elimination half-life of ARGs in compost based on absolute abuandance (C)

图 5 试验组高温堆肥过程中耐药基因绝对丰度的消减曲线Fig.5 Dissipation kinetics of ARGs during composting based on aboslute abundance

图 6 试验组高温堆肥过程中耐药基因相对丰度的消减曲线Fig.6 Dissipation kinetics of ARGs during composting based on relative abundance

3 讨论

3.1 堆肥对耐药大肠杆菌的去除效果对比

养殖业中大量使用抗生素使得大量未被利用的抗生素直接接触环境，导致抗生素赋存浓度升高.农业生产中畜禽粪污还田还会将残留的抗生素带入农田土壤. 兽用抗生素不仅导致养殖环境的抗生素污染，还可引发环境内耐药细菌的出现. 随着广谱抗菌药物的广泛应用，细菌的耐药性正在不断增加并呈现多重耐药甚至泛耐药性的趋势. 堆肥是去除抗生素耐药菌的有效手段，前期研究表明，经过二次腐熟后堆肥能够有效杀灭致病菌(沙门氏菌和大肠菌群)，并且能够有效消减四环素耐药菌的绝对数量.在此次模拟堆肥中，到第5天已经没有可培养的大肠杆菌被检出，肠杆菌16S rRNA基因的绝对丰度从最初的5.37×10copies/g逐渐降至1.50×10copies/g(第30天)，其消减率为97.15%，同时可培养的多重耐药菌总数也降低了5～6个数量级. 与这一结果类似的是，李含雄等研究发现，粪便中大肠杆菌数量大于10CFU/g，但通过控制堆肥温度可以在12 h～5 d内将大肠杆菌全部杀灭.

3.2 堆肥对耐药基因的去除效果对比

磺胺类药物是第一批可以全身使用的选择性作用于细菌的药物，如今它们很少被使用，部分原因是磺胺类药物极易产生耐药性并会在环境中广泛传播.Le-Devendec等在对鸡粪为期6周的堆肥试验结果表明，磺胺类抗生素耐药基因的相对丰度逐渐下降了3～4个数量级. Wu等在对猪粪的普通堆肥中发现，的绝对丰度有明显下降，堆肥结束后其消减率为85.79%. 这与笔者所得结果一致，此次试验中基因的绝对丰度从初始的4.71×10copies/g降至9.46×10copies/g(第30天)，最终消减率为97.99 %.然而也有部分研究结果显示，在堆肥过程中耐药基因绝对丰度会有所升高或在堆肥结束后耐药基因会有所富集. 这些结果说明，不同堆肥原料会影响磺胺类耐药基因的去除，温度可能通过影响磺胺抗性质粒在堆肥中的存活能力和接合转移能力，进而使得堆肥进程中耐药基因相对丰度发生改变.

多黏菌素是一种发现于多黏杆菌培养液中的具有抗菌活性的多肽.是在我国首次发现的第一个肠杆菌科中质粒介导的多粘菌素抗性机制的耐药基因，并且含有基因的质粒具有较高的体外转移率(10～10)，会在人类群体中广泛传播，影响人类的正常生活和疾病治疗. Xing等采用半透膜堆肥法对铜污染鸡粪中和的去除效果进行了评价，结果表明，低铜处理组的相对丰度降低了80.1%. 还有研究显示，在堆肥过程中，15 d的高温(44～65 °C)堆肥后，粪便中超过90%的基因被消除，22 d后完全检测不到基因. 这些研究都与笔者所得结果相近，在此次试验中耐药基因的绝对丰度从1.97×10copies/g降至2.09×10copies/g，消减率为99.89%.的相对丰度在堆肥结束后降低了3个数量级. 这些研究结果表明，堆肥能够有效去除粪便中携带的高风险抗生素耐药基因.

有研究表明，和基因有着紧密关系，Yang等在33个多重抗生素抗性细菌的分离菌株中检测到了12种移动遗传元件的存在，并且最终证实所有++均与Ⅰ类整合酶基因相关. 该试验使用的5A5菌株携带质粒就是这种Ⅰ类整合酶基因的结构，因此基因的消减特征与基因类似，在模拟堆肥结束后，通过计算得出试验组中和基因的消减速率常数分别为0.119和0.103 d，进一步说明连锁基因结构使其具有相似的消减速率，另外，由于基因位于整合子结构上，其消减速率明显低于、等独立基因. 整合子能够参与基因的水平转移，使得耐药基因且在堆肥过程中不容易被去除，这一理论在许多研究中得以证实. Tang等在堆肥过程中发现大多数耐药基因的拷贝数减少，但基因是唯一绝对丰度增加的基因，同样在4种可移动遗传元件中，只有基因的绝对丰度增加，说明可移动遗传元件可能显著影响与其相连的耐药基因的绝对丰度.

研究表明，经过好氧堆肥处理后，抗生素耐药基因的绝对丰度均得到了有效降低. 孙伟等在污泥堆肥过程中发现，多种耐药基因在堆肥过程中的消减率均超过85%. Li等研究了在鸡粪堆肥中添加竹炭对耐药基因的影响，发现26 d后，大多数耐药基因和基因的相对丰度下降了21.6%～99.5%. 在此次模拟堆肥过程中耐药基因的绝对丰度表现出随堆肥时间的延长呈持续降低的特征，且在30 d的高温堆肥过程中，笔者选取的耐药基因(aadA、sul2、mcr-1、oqxB)和intI1基因的消减率为80.00%～97.99%.大多数耐药基因的相对丰度表现出先降后略微升高的趋势，其中，耐药基因aadA、sul2、mcr-1、oqxB和intI1基因的相对丰度消减率为86.37%～99.89%. 综上，堆肥是处理畜禽养殖源多重耐药菌及其耐药基因污染的有效手段.

4 结论

a) 在模拟堆肥过程中，经过3 d的高温期后，未检出可培养的多重耐药大肠杆菌；经过10 d堆肥后，普通的多重耐药菌数量降低了4～6个数量级.

b) 多重耐药菌中耐药基因的绝对丰度和相对丰度均随着高温堆肥过程出现显著下降，其中4种耐药基因(aadA、sul2、mcr-1、oqxB)的绝对丰度消减率为89.39%～99.89%，相对丰度消减率为86.37%～99.89%.值得注意的是，整合子上携带的aadA基因消减量低于mcr-1等非整合子基因盒内基因，相对丰度也有类似规律.

c) 通过拟合堆肥条件下intI1(整合酶)基因和耐药基因的消减曲线，进一步获得了高温堆肥过程中不同耐药基因的半消减期. 一方面，堆肥过程中耐药基因的相对丰度比绝对丰度更难消减；另一方面，与整合子相连的耐药基因有着更长的半消减期，即更难通过堆肥过程去除.