染料木素磺酸钠对慢性脑缺血大鼠皮层神经元凋亡及Notch1信号的影响

王恺迪，郭荣旺，刘锦红，谭雅薇，张丽梅，黄志华，帅 萍，黎 晓

（1.赣南医学院2019级硕士研究生；2.赣南医学院2018级本科生；3.赣南医学院2019级本科生；4.赣南医学院基础医学院；5.赣南医学院第一附属医院病理科，江西 赣州 341000）

脑血流灌注不足可引起神经元损伤和神经功能障碍，其中慢性脑缺血是长期脑血流灌注不足的一种病理状态，多见于老年人，易促发血管性痴呆（Vascular dementia，VD）、阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）和皮质下动脉硬化性脑病（Binswanger disease，BD）等神经系统退行性疾病［1］，其发病率随着老龄化社会的步入而与日俱增，给社会造成巨大负担。然而，迄今对慢性脑缺血损伤机制却不甚明了，临床对慢性脑缺血引起的脑疾病也无确切有效的治疗措施。目前认为，细胞凋亡（Apoptosis）是慢性脑缺血损伤机制之一，因其受多环节、多信号调控而颇受关注。研究表明，Notch1 信号参与了脑缺血再灌注损伤后神经元凋亡的调控［2］，但是否参与了慢性脑缺血诱导的神经细胞凋亡尚缺乏直接证据。

中医中药治疗缺血性脑疾病具有得天独厚的安全性和可靠性，特别是一些中药单体应用有着不逊于西药的效果［3-4］。因中药单体的分子结构明确、来源安全可靠，且具有多靶点活性而倍受关注。前期我们也关注了植物雌激素染料木素的结构修饰体——染料木素磺酸钠（Genistein-3'-sodium sulfonate，GSS）的神经保护作用。结果显示，GSS对大脑中动脉栓塞再灌注损伤模型大鼠有较好的脑保护作用，能有效降低缺血再灌注损伤（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠神经功能学评分和减小脑梗死体积，并初步证明，GSS的脑保护机制可能与其调控胶质细胞活化、抑制炎症反应有关［5］。前期研究发现，GSS 可通过激活ERK 等信号调节MCAO 大鼠脑组织中凋亡相关基因的表达［6-8］，但Notch1信号通路是否参与了GSS调节慢性脑缺血所诱导的神经细胞凋亡作用尚未探明，本研究通过复制SD 大鼠双侧颈总动脉结扎（Two-vessel occlusion，2-VO）模型对此进行初步探讨，旨在为进一步探明GSS的脑保护机制提供一定实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物雄性SD 大鼠，6～8周龄，体重180～200 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司［动物使用许可证号：SYXK（赣）20180004，动物合格证号：430727210100264331，级别：SPF 级］。动物实验于项目申报时经赣南医学院医学伦理委员会审核，使用动物均遵循《动物保护和使用指南》（第85-23号出版物，1985年修订），并与欧盟指令2010/63/EU中报告的使用实验动物的欧洲准则相一致。

1.2 实验药物和试剂染料木素磺酸钠（分子式C15H10O8SNa），为白色结晶粉末，纯度≥99%，购自上海天习化工有限公司，使用前以生理盐水溶解成所需浓度；Bax、Notch1 抗体（货号：2772S、4147S）购自Cell signaling Technology公司；Bcl-2（货号：ab194583）购自Abcam 公司；Cleaved Caspase-3 抗体（货号：WL02117）购自Wanleibio 公司；β-Tubulin、β-actin 抗体（货号：MA5-11732、MA5-15739）购自Invitrogen 公司；山羊抗兔IgG（货号：31460）、山羊抗鼠IgG（货号：31430）等二抗及PVDF 膜（货号：88518）、蛋白定量试剂（货号：A33972）、增强化学发光试剂（货号：34580）等均购自Thermo fisher 公司；反转录试剂盒（货号：C28025）购自Invitrogen 公司；SYBR®Select Master Mix：Life techno logier（货号：4472908）购自Life Technologies 公司；引物由广州易锦生物技术有限公司合成。

1.3 实验分组与给药大鼠采用数字随机分组法分为Sham组、2-VO+Vehicle组、2-VO+GSS组（1 mg·kg-1GSS），每组10 只。GSS 经腹腔注射给药，Sham 组和2-VO+Vehicle 组腹腔注射同体积的生理盐水，每天1次，连续给药8 W。

1.4 双侧颈总动脉结扎（2-VO）大鼠改良模型制备以1%戊巴比妥钠［0.4～0.5 mL·（100 g）-1］腹腔注射麻醉大鼠，于颈部正中切开，逐层分离皮下结缔组织，暴露并仔细分离右侧颈总动脉，穿2 根1#手术线作双重永久性结扎，1 周后用相同方法分离并结扎左侧颈总动脉。Sham 组仅分别暴露双侧颈总动脉，但不结扎。术中严格控制室温在23～25 ℃，且注意勿损伤伴行的迷走神经等。第二次手术后次日开始腹腔注射给药，连续注射8 W。

1.5 尼氏染色观察大鼠皮层神经元形态及尼氏小体分布情况取新鲜组织包埋后，于冰冻切片机上连续冠状切片，切片厚度为30 µm。裱片后行尼氏染色10 min，在显微镜下观察大鼠皮层组织中神经元形态及尼氏小体数量，并计数×20 倍镜下5 个视野的尼氏小体个数，以占比Sham 组比例进行统计分析。

1.6 Real time-PCR 方法检测Bax、Bcl-2 和Casepase-3 的mRNA 表达水平给药8 W 后，取大鼠大脑皮层组织10～20 mg 于冰上制备组织匀浆，加入10倍体积的Trizol充分裂解后，加入1/5体积氯仿，混匀，静置5 min，4 ℃12 000 g 离心15 min，取上清，加入等体积的异丙醇，轻柔混匀，置于-20 ℃静置一段时间，4 ℃12 000 g 离心15 min，弃上清，用DEPC 水配制的75%乙醇清洗沉淀一遍，离心，弃乙醇上清，干燥5 min，待乙醇蒸发干，继续用约20µL的无RNA 酶水溶解，定量至500 ng·mL-1，进行后续逆转录实验。逆转录完成后，进行实时定量PCR 实验。qPCR 反应体系：cDNA 2µL、1×SYBR 10µL、加超纯水至20 µL。反应条件：95 ℃预变性20 min，PCR 反应，95 ℃变性10 s，61 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s，共40个循环。引物序列参见表1。

表1 引物序列

1.7 Western blot 检测Bax、Bcl-2、Casepase-3 和Notch1 蛋白表达取大脑皮层组织加入细胞裂解液充分裂解后，4 ℃离心（12 000 g，5 min），BCA 方法进行蛋白定量，取20 µg 总蛋白加入上样缓冲液煮沸变性，经SDS/PAGE 凝胶电泳，然后电转移至PVDF 膜，封闭后，一抗4 ℃过夜，二抗室温孵育1 h，增强化学发光试剂孵育1 min 后，化学发光免疫定量分析系统照相后灰度分析。

1.8 统计学方法数据采用Prism 8.0软件进行统计分析，计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GSS 对2-VO 大鼠皮层神经元的保护作用尼氏染色结果显示，Sham 组大鼠皮层神经元数量多且密集，形态结构完整，且细胞质中的尼氏小体丰富，而2-VO+Vehicle 组神经元数量明显减少，差异有统计学意义（P＜0.001），细胞形态出现明显异常，多为空泡状，排列紊乱且稀疏。经GSS治疗后神经元数量较2-VO+Vehicle 组明显增加，差异有统计学意义（P＜0.001），细胞形态趋于正常且排列紧密，尼氏小体数量也显著增多（图1）。

图1 GSS对2-VO 大鼠皮层神经元的保护作用

2.2 GSS 减少2-VO 大鼠皮层神经元凋亡Real time-PCR方法检测各组大鼠凋亡标记性分子mRNA水平，结果显示，与Sham 组比较，2-VO+Vehicle 组大鼠皮层组织中促凋亡因子Casepase-3、Bax mRNA 水平明显升高（P＜0.001），而抑凋亡因子Bcl-2 的mRNA水平下降（P＜0.05），经GSS治疗后得到部分逆转（P＜0.05）（图2）。进一步应用Western blot 方法检测各组大鼠大脑皮层组织中凋亡标记性分子的蛋白表达水平，结果显示，与Sham组比较，2-VO+Vehicle组促凋亡分子Caspase-3 的蛋白表达水平明显升高（P＜0.001），Bax 蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），但抑凋亡分子Bcl-2 的蛋白表达水平及Bcl-2/Bax蛋白表达水平比值则明显降低（P＜0.05），经GSS 治疗后此现象得到逆转，且与2-VO+Vehicle组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

图2 GSS调节2-VO大鼠皮层神经元中凋亡相关分子的mRNA表达水平

图3 GSS调节2-VO大鼠皮层神经元中凋亡相关蛋白表达水平

2.3 GSS 激活Notch1 抑制神经元凋亡与Sham组比较，2-VO+Vehicle 组大鼠中Notch1 蛋白表达水平显著下降（P＜0.05），经GSS 治疗后得到逆转（P＜0.001）（图4）。

图4 GSS调节2-VO大鼠皮层神经元中Notch1的蛋白表达水平

3 讨论

细胞凋亡（Apoptosis）是一种受多基因严格控制的程序性细胞死亡方式之一，其主要通过两种途径启动：死亡受体/Fas途径和线粒体途径。其中，前者由Caspase-8 介导，而后者由Caspase-9 介导，主要受Bcl-2家族蛋白调控，但两条途径都是从活化Caspase启动的［9］，且启动后都将通过进一步激活下游分子Caspase-3，继而促进细胞凋亡［10-11］。因此，Caspase-3是公认的最关键效应蛋白酶，也是发生凋亡的标志酶［12］。此外，目前认为，凋亡过程一直处于动态变化，并要取决于Bcl-2和Bax的表达量［13］，其中Bax为促凋亡因子，当Bax表达增多时，形成的Bax-Bax同源二聚体在线粒体外膜形成离子通道，因而改变线粒体通透性，引起细胞色素C释放，进而激活Caspase-9，再激活Caspase-3，从而启动凋亡级联反应；反之，当Bcl-2 表达增多时，形成的则主要是Bcl-2-Bcl-2 同源二聚体或Bcl-2-Bax 异源二聚体，两者均起抑制细胞凋亡的作用。因此，Bcl-2/Bax 比例往往被认为是衡量细胞凋亡是否启动的直接有效指标。文献表明，慢性脑缺血后，长期的低灌注状态导致颅内产生大量氧自由基、线粒体损伤等，均可引起大脑神经元体积减小、胞质浓缩、核固缩等神经元凋亡的典型形态学特征。Bcl-2 和Caspase-3 在调节脑细胞凋亡中的作用也已得到广泛实验证实。有研究认为，增加脑内Bcl-2的表达可减少脑梗死病灶的大小，对神经元有保护作用，而Caspase-3 作为Bcl-2 的下游调控蛋白，其活性在Bcl-2 过量表达时能被有效抑制，从而中止细胞凋亡的发展。本研究中2-VO 大鼠大脑皮层组织中Caspase-3 基因与蛋白表达水平均升高，Bax 基因水平也升高，但Bcl-2 基因及蛋白表达水平则下降，Bcl-2/Bax 蛋白表达率下降，经GSS 治疗后，这些现象均得到逆转，即GSS 减少2-VO 大鼠皮层神经元凋亡，说明GSS 能有效抑制慢性脑缺血所诱导的神经元凋亡。

研究显示，Notch 信号通路参与了细胞分化、增殖、存活和发育等过程。哺乳动物体内含4 种同源Notch 受体（Notch1～4）及5 种同源配体，其中Notch1广泛表达于多种组织中。在脑缺血/再灌注损伤大鼠模型中，电针百会、大椎可以明显提高缺血侧海马区Notch1 表达，改善模型大鼠神经缺损症状。说明Notch1 可能参与了神经元损伤与存活的调节［14］，但Notch1 在缺血性脑病中对神经元凋亡的调节作用扮演何种角色，目前尚未明确。程连臣等［2］认为，Notch1 在脑缺血再灌注损伤中可能具有抑制神经细胞凋亡的作用，而在脑缺血再灌注损伤后抑制Notch1 却促进神经细胞发生凋亡，其作用机制可能与增强Akt 磷酸化水平、促进Bad 失活有关。PI3K/Akt 信号通路在细胞生长、生存和代谢中起主要调节作用已有研究报道，并且Notch1 可通过PI3K/Akt信号通路抑制肿瘤组织中药物引起的或p53介导的细胞凋亡［15］。我们的研究结果也显示，Notch1 在慢性脑缺血大鼠模型中可能起抑制大脑皮层神经元凋亡的作用，这可能与慢性脑缺血过程中大脑皮层一直处于低灌注状态有关，且GSS 可能通过激活Notch1 活性发挥脑保护作用，其确切的证据仍需进一步研究。