基于网络药理学探讨桂枝附子汤治疗骨关节炎的作用机制

廖俊招，施伟梅，陈治希

（赣南医学院药学院，江西 赣州 341000）

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是世界上最常见的关节疾病之一，主要临床症状包括关节软骨纤维化、溃疡、剥脱、关节畸形和关节间隙狭窄等［1-2］。研究表明，OA 的发病率呈不断上升趋势，且发病率可能与年龄、肥胖、炎症、创伤及遗传等因素有关［3-4］。目前临床上尚未出现特效疗法治疗OA，单纯的西医治疗主要以降钙素、非类固醇类抗炎药及二膦酸类等药物进行保护关节软骨、缓解疼痛、延缓病情发展等为主，但长期使用会对骨质、胃肠道及心血管造成损伤，无法从根本上治愈OA［5-6］。因此，鉴于临床上缺少长期有效的治疗方案，开发挖掘新的治疗方法已迫在眉睫。

由于传统中药安全性高、疗效确定，并对各期OA 的治疗均有独特优势，以中医药方案治疗OA 已经引起广泛关注［7］。在网络药理学兴起的同时，各种中药作用机制逐步被明确。研究表明，桂枝附子汤能缓解OA 的临床症状［8-9］，桂枝附子汤出自《伤寒论》，具有祛风温经、助阳化湿之功效［10］。OA 在中医上属于“痹证”范畴，我国历代医学家认为该病主要是由“风、寒、湿”三邪引起［11-12］。有研究表明，桂枝附子汤对治疗营卫不和、寒湿痹阻型骨关节炎有较好疗效。桂枝附子汤在治疗寒湿痹阻证型骨关节炎可有效缓解病情，同时降低患者TNF-α、IL-1、IL-7等关节液炎症因子的表达，并不会对胃肠道、心血管造成明显损伤，但其作用机制还不明确［8］。本研究采用网络药理学的方法分析探讨中药复方桂枝附子汤对OA的作用机制。现报告如下。

1 方 法

1.1 桂枝附子汤活性成分与潜在靶点筛选综合文献报道以及利用TCMSP（https：//tcmsp-e.com/），以“白附片、桂枝、生姜、大枣”为关键词检索，查找这几味药的化学成分，然后以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（Drug-likeness，DL）≥0.18 为筛选条件，收集符合条件的有效成分，并收集TCMSP 数据库中有效成分对应的靶点，同时使用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）数据库将靶点转换标准基因名。

1.2 OA 靶点应用Genecards 数据库（https：//www.genecards.org/）和OMIM 数据库（https：//omim.org/），以“Osteoarthritis”为关键词，检索OA疾病相关靶点。合并两个数据库的疾病靶点并删除重复靶点，提取相关度靠前的1 000 个靶点，将疾病靶点与药物靶点匹配获取交集靶点基因，并绘制韦恩图［13］。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建将桂枝附子汤治疗OA 的潜在靶点导入string 数据库（https：//string-db.org/）中，限定物种为“Homo sapiens”，最小相互作用阈值设为高等“Highest confidence（0.9）”，其余设置均为默认设置，得到桂枝附子汤作用于OA 的PPI网络，保存为TSV 格式文件。并通过Cytoscape 3.8.2 软件中的MCODE 插件对PPI网络进一步分析，绘制核心靶点之间的PPI图。

1.4 药物-活性成分-靶点网络的构建将药物的活性成分和靶点信息处理后导入Cytoscape 3.8.2软件中绘制药物-成分-靶点网络图，然后使用Network Analyzer 对其进行分析，再根据节点连接度（Degree）值从大到小对网络图进行调整，药物活性成分和靶点的作用以节点表示，节点之间的相互作用以“边”表示，节点的大小反映Degree的大小。

1.5 GO 和KEGG 富集分析采用David 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）对桂枝附子汤治疗OA的潜在靶点进行GO（Gene Ontology）富集分析及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析，设定物种和背景为“Homo sapiens”，然后导出数据，对GO（P＜0.01）和KEGG（P＜0.05）进行筛选。选择前20 个GO 及KEGG 信息，借助微生信网站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）进行数据可视化处理，以阐释桂枝附子汤治疗OA 的生物功能及相关信号通路。

1.6 OA 靶点-通路网络图的构建运用Cytoscape 3.8.2 构建OA 靶点-通路网络图，利用Cytoscape 3.8.2 内置工具（Network Analyze）分析有效成分和靶点的网络拓扑学，并根据网络拓扑学参数连接度（Degree）、紧密度（Closenesss）及介度（Betweenness）等判断核心靶点及发挥药效的活性成分。

2 结果

2.1 桂枝附子汤成分靶点的获取通过文献报道及TCMSP 数据库的挖掘，经ADME 筛选后得到活性成分30 个，其中白附片6 个，生姜4 个，大枣19 个，桂枝6 个，见表1。并在TCMSP 数据库中收集其有效成分对应的靶点，用Uniprot数据库将所得靶点蛋白名称转换为标准基因名，合并后删除重复和无效靶点，共获取作用靶点205 个，利用Cytoscape 3.8.2软件绘制桂枝附子汤药物-活性成分-靶点网络图，见图1。

图1 药物-活性成分-靶点

表1 桂枝附子汤的活性成分

2.2 OA 相关靶点的筛选通过Genecards 数据库和OMIM数据可搜索到OA相关靶点，将两个数据库的基因合并去重后共得到疾病靶点3 135 个，提取相关度相对较高的前1 000 个［14］，其中相关度最高的前30 的靶点，见表2。将桂枝附子汤治疗OA 的潜在靶点与疾病靶点在韦恩图中映射筛选出共同靶点85个，见图2。

图2 活性成分靶点-骨关节炎靶点韦恩图

表2 骨关节炎相关度较高的靶点

2.3 PPI 网络构建与分析通过string 网络平台在线构建桂枝附子汤治疗OA 潜在靶点PPI网络，将结果以图片形式导出，见图3。共有节点85 个，边数345 条，平均节点数为8.12，平均局部聚类系数为0.499。由于string 数据库分析是无向的，使用Cytoscape 3.8.2 软件分析PPI 网络中存在部分密度较高的区域（module），module 的连线密度较高，是PPI 的潜在子网，被认为是具有一定生物学意义的集合。为了更加精准地分析桂枝附子汤治疗OA 的作用机制，运用Cytoscape 3.8.2 中的插件MCODE，通过一定的算法对相互作用关系进行分析，得到PPI网络中的核心子网络，见图4。

图3 枝附子汤-骨关节炎靶点PPI网络

图4 桂枝附子汤-骨关节炎靶点PPI网络中的module

2.4 GO 富集分析对桂枝附子汤治疗OA 潜在靶点进行GO 功能富集分析，富集结果包括生物过程（BP）、分子功能（MF）以及细胞组分（CC）3个部分，见图5。桂枝附子汤治疗OA 所涉及的生物过程主要包括对脂多糖的反应、凋亡信号通路、对类固醇激素的反应、对生长因子的反应、对氧气水平的反应等过程。涉及的分子功能主要有DNA 结合转录因子结合（DNA-binding transcription factor binding）、细胞因子受体结合（Cytokine receptor binding）、转录共调控结合（Transcription coregulator binding）、趋化因子受体结合（Chemokine receptor binding）、抗氧化活性（Antioxidant activity）等功能。涉及的细胞组分主要是膜筏（Membrane raft）、转录调节复合体（Transcription regulator complex）、细胞外基质（Extracellular matrix）、质膜外侧（External side of plasma membrane）、过氧化物酶体（Peroxisome）等。

图5 GO富集分析

2.5 KEGG 富集分析将桂枝附子汤治疗OA 潜在靶点进行KEGG 功能富集分析，根据P＜0.05 进行筛选，选择其中基因富集程度最高的前20条作用通路绘图，见图6。通路上的基因数反映在气泡大小上，其颜色代表基因在该条通路上的富集程度。通过KEGG 富集分析，发现涉及桂枝附子汤治疗OA的作用通路主要有：肿瘤坏死因子信号通路（Tumor necrosis factor signaling pathway）、Toll 样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）、PI3K-Akt 信号通路（PI3K-Aktsignaling pathway）、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、T 细胞受体信号通路（T cell receptor signaling pathway）等。

图6 KEGG富集分析

2.6 OA 靶点-通路网络图的构建使用Cytoscape 3.8.2 软件，以KEGG 富集分析中基因数目最多的前20个通路为基准，做OA靶点-通路网络图，见图7。通过NetworkAnalyzer 分析桂枝附子汤治疗OA 网络拓扑学参数，得到核心作用靶点，见表3，RELA 在网络中的连接度为18，介度为0.053，紧密度为0.53，推测RELA 可能为桂枝附子汤治疗OA的最主要靶 点。另 外，AKT1、MAPK1、TNF、MAPK8、JUN、NFKBIA、IL-6 等都是相对比较重要的靶点。

表3 KEGG通路分析相关靶点

图7 KEGG通路及富集基因关系网络

3 讨论

骨关节炎是一种发病率比较高的退行性骨科疾病，有研究表明，目前全世界关节炎患者超过3.6亿［15］。致病因素有很多，患者的年龄覆盖比较广，目前的治疗效果不尽如人意。

中医药是我国的瑰宝，有5 000 多年的历史，在治疗疾病方面有其独特的优势，且毒副作用比较小。桂枝附子汤出自汉代《伤寒论》，具有祛风温经，助阳化湿之功效，OA 在中医上属于痹症的范畴，桂枝附子汤正对其症［10］。

本研究基于网络药理学并挖掘相关数据库，探究桂枝附子汤治疗OA的潜在靶点和作用机制。结果表明，治疗OA 的关键靶点主要有RELA、AKT1、MAPK1、TNF、MAPK8、JUN、NFKBIA、IL-6，其中RELA的连接度最高，在炎症过程中，RELA基因作为NF-κB亚家族中重要的一员参与了多种炎症反应，促炎细胞因子和趋化因子促进NF-κB的转录，NF-κB基因表达诱导关节损伤的临床症状［16-17］。除此之外，IL-6作为细胞炎症因子的一种，可直接引起关节软骨和软骨基质的破坏［18］，最新研究表明中药贴膜主要以IL-1、IL-6 和TNF-α 为靶标治疗骨关节炎［19］，而IL-6正是PPI分析核心子网络的重要组成部分。

桂枝附子汤治疗OA信号通路主要涉及PI3K-Akt信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、Toll样受体信号通路、HIF-1 信号通路等信号通路，越来越多的研究表明PI3K-Akt 信号通路在治疗OA 中起非常重要的作用［20-21］。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路是非常经典的信号通路，存在于多种细胞中，是调节细胞生长、增殖、分化、代谢等生命活动的重要基点。最近的研究表明，miRNA-103 通过降低SPHK1 的活性，从而抑制PI3K/Akt 信号通路的活性，进而影响OA 的进程，促进OA 软骨细胞的凋亡，由此可见，PI3K/Akt 信号通路对OA 软骨细胞具有保护作用［22-23］。此外，宋伟等发现，落新妇苷可能通过作用于STAT1、STAT3、RAS 等OA 的靶点，抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达，从而调节CCND1 的表达，促进软骨细胞增殖和抑制炎症因子产生［24］。这也从侧面证实了PPI分析核心子网络中蛋白Akt、STAT的重要性。

本研究结果表明，桂枝附子汤的同一化合物对应多个靶点，而同一靶点又参与多个生物过程及信号通路，体现了桂枝附子汤多通路、多靶点联合作用的特点。但由于网络药理学方法的局限性，未能在体内进行验证研究结果。本研究后续将在此基础上进一步建立细胞及动物模型进行验证，进而为桂枝附子汤治疗OA提供临床依据。