膝关节骨性关节炎miR-138 HIF-2α表达与意义

林利忠 关助明 林泽金

膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是临床上较为常见的一种慢性骨关节疾病[1-2]，早期诊断及积极治疗可有效延缓疾病进展并及早对预后做出判断。微小核糖核酸(microribonucleic acid，miRNA)是由20～24核苷酸组成的小分子非编码RNA，可通过调控下游靶基因表达而参与多种生理病理过程[3]。穆尚强等[4]研究证实，在KOA患者的关节液中有多种miRNAs的表达均有异常。关节软骨主要从流动的关节液及软骨下骨中获取营养和氧，关节软骨中低氧诱导因子-2α(hypoxia inducible factor-2α，HIF-2α)能够调控软骨细胞对低氧环境的适应性[5]。相关研究[6-7]发现，在KOA患者的关节液中miR-138呈显著下调，关节软骨中HIF-2α信使RNA(Messenger RNA，mRNA)呈显著上调，二者均有可能是KOA前期

的检查和诊断的监测标志物。为了进一步研究KOA患者关节液中miR-138和关节软骨中HIF-2α的作用，本研究利用检测二者的表达，并探讨其变化与意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年3月至2019年1月深圳龙华区中心医院收治的46例KOA患者作为研究组，参照凯尔格伦-劳伦斯(Kellgren-Lawrence，K-L)分级标准[8]对KOA患者(研究组)进行分级：Ⅱ级11例、Ⅲ级22例、Ⅳ级13例。同时选取46例同期非KOA患者(因发生车祸或严重损伤等需要进行下肢截肢手术且均为非KOA患者)作为对照组。两组患者一般资料进行比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组患者一般资料比较

1.2 纳入与排除标准 研究组纳入标准：均符合美国风湿病学会KOA诊断标准[9]者。研究组排除标准：膝关节创伤者；膝关节有手术史者；近期接受非甾体类抗炎药或糖皮质激素类治疗者；有自身免疫性疾病或炎症性关节炎者。对照组排除标准：有严重心、肝、肾疾病者；关节软骨破损严重者；有血液病者；有恶性肿瘤者。本研究经医院伦理委员会批准(审批号：201802-001)，所有患者均知情同意。

1.3 样本的收集及储存

1.3.1 关节液标本 无菌收集两组患者的关节液各约3 mL，室温条件下静置1 h后，于离心机内以3 500 r/s转速离心处理10 min。去除细胞和关节组织残存碎片，分离上清液于新的EP管，-80℃超低温冰箱中保存待测。

1.3.2 关节软骨标本 两组患者均在术中切除关节软骨，所有标本均在离开体后30 min内取材完成并于-80℃超低温冰箱保存备用。

1.4 检测方法

1.4.1 关节液中miR-138表达检测 采用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测。分别取两组患者关节液各3 mL并提取其中的总RNA，使用微量分光光度计检测浓度和纯度。然后将总RNA逆转录为互补的脱氧核糖核酸(complementary Deoxyribonucleic Acid，cDNA)。逆转录反应条件：16℃ 30 min→42℃ 30 min→85℃ 5 min。U6的逆转录反应条件为：37℃ 30 min→85℃ 5 min。取1 μL逆转录产物进行进行qRT-PCR。以U6作为内参，正向引物为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物为：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；miR-138正向引物为5’-AGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCG-3’，反向引物为：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；反应条件：95℃ 10 s；95℃ 15 s→60℃ 20 s 40个循环；60℃ 3 min。2-ΔΔCt法计算关节液中miR-138的相对表达量。

采用qRT-PCR法检测关节软骨中HIF-2α表达情况：分别取两组患者软骨组织标本各80 mg，提取软骨组织总RNA，应用紫外分光光度计测定每个样本总RNA的A260/A280的比值，逆转录为cDNA。HIF-2α上游序列：5’-GAGGGTTTCATTGCTGTGGT-3’，下游序列：5’-CTCACGGATCTCCTCATGGT-3’；内参为β-actin，上游序列：5’-TCGATATAGCTATAGCTAGC-3’；下游序列：5’-TCGATAGAGAGCAAGCTAGC-3’。反应条件：94℃ 10 s；94℃ 10 s→60℃ 35 s，共40个循环；60℃ 3 min。2-ΔΔCt法计算关节软骨中HIF-2α的相对表达量。

研究组患者膝关节置换术后随访1年，复发判断标准[10]：①近1个月大多时间感到膝痛；②有骨赘形成；③膝关节活动时有骨膜擦音；④晨僵<0.5 h。将随访期间符合上述标准者记为复发，不符合则记为未复发。

1.5 观察指标 观察比较两组患者关节液中miR-138及关节软骨中HIF-2α表达比较；比较研究组不同分级患者关节液中miR-138和关节软骨中HIF-2α表达；比较研究组未复发及复发患者关节液中miR-138和关节软骨中HIF-2α表达情况。

2 结果

2.1 两组患者关节液中miR-138及关节软骨中HIF-2α表达比较 研究组关节液中miR-138表达低于对照组，研究组关节软骨中HIF-2α表达高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组患者关节液中miR-138与关节软骨中HIF-2α表达比较

2.2 研究组不同分级患者关节液中miR-138和关节软骨中HIF-2α表达比较 不同分级患者关节液中miR-138和关节软骨中HIF-2α表达比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；与Ⅱ级相比，研究组患者Ⅲ级和Ⅳ级关节液中miR-138表达均显著降低，Ⅳ级又显著低于Ⅲ级，差异有统计学意义(P<0.05)；相较于Ⅱ级，研究组患者Ⅲ级和Ⅳ级关节软骨中HIF-2α表达均显著升高，Ⅳ级又显著高于Ⅲ级，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 研究组不同分级患者关节液中miR-138与关节软骨中HIF-2α表达比较

2.3 研究组未复发及复发患者关节液中miR-138和关节软骨中HIF-2α表达情况比较 研究组患者术后1年，共有7例患者出现复发。复发患者关节液中miR-138表达低于未复发患者，复发患者关节软骨中HIF-2α表达高于未复发患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 未复发与复发患者关节液中miR-138和关节软骨中HIF-2α表达情况比较

3 讨论

本研究结果显示，研究组患者关节液中miR-138表达低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示KOA患者关节液中miR-138表达显著下调，且患者分级越高关节液中miR-138表达越低，提示KOA患者关节液中miR-138表达减少，且与患者病情严重程度有关。关节液主要由关节滑囊及腱鞘的滑液膜分泌，若膝关节发生病变，分泌的关节液中会出现病变代谢产物，并潴留在关节腔内。miRNA主要是通过与RNA上对应的应答元件相结合发挥功能。有研究[11-12]显示，miRNA广泛参与机体的生理病理过程，当miRNA与靶基因结合时，可起到抑制或促进基因表达的作用。另有报道[13]指出，miR-138可作用于G蛋白偶联受体激酶6，调节B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)及Bcl-2同源水溶性相关蛋白Bax，进而促进软骨细胞增殖并抑制其凋亡，根据上述报道可推测KOA患者关节液中miR-138表达下降，对软骨细胞的增殖和凋亡调节功能减弱，使得软骨细胞增殖减少而凋亡增多，因此可加重软骨病理改变。此外，miR-108表达下降可影响局部代谢，使得有害代谢物质如促炎症因子等潴留，也是诱发并加重关节软骨病变的主要原因[14]。本研究与上报道和分析相符，提示miR-108可能是KOA治疗研究的潜在靶点。

本研究结果显示，研究组关节软骨中HIF-2α的表达高于对照组，且研究组分级越高其表达越高，差异有统计学意义(P<0.05)，提示KOA患者HIF-2α表达显著上调，且可能参与病情进展。HIF-2α对关节软骨中的低氧诱导极为重要，主要在高分化的软骨细胞中表达，是胚胎骨骼发育和培养软骨细胞的软骨内成骨所必须的细胞因子[15]。研究[16]发现，HIF-2α可能与关节软骨细胞的破坏及凋亡有关，是关节软骨的主要调控因子，可以通过调控基质分解酶类和多种炎症因子等的表达诱发软骨破损。另一方面，HIF-2α高表达可致使关节软骨更易受到损害，进而加重KOA患者的病情。此外，本研究中,研究组复发患者关节液中miR-138表达低于未复发患者，而关节软骨中HIF-2α表达高于未复发患者，差异有统计学意义(P<0.05)，推测二者异常表达可能与KOA复发风险有关。有报道[17]指出，miR-138表达下降可能导致关节炎患者细胞免疫紊乱，而细胞免疫紊乱则是影响患者预后的重要因素，但既往尚未见关于关节液中miR-138及关节软骨中HIF-2α异常表达与KOA患者复发的关系报道，但是结合上述分析可以推测关节液中miR-138表达下降可导致软骨细胞大量凋亡，关节软骨中HIF-2α高表达则可参与关节软骨损害，因而二者均可增加KOA复发的风险。

综上所述，关节液中miR-138及关节软骨中HIF-2α表达与KOA的发生、发展及复发风险评估均有关。推测关节液中miR-138、关节软骨中HIF-2α可能是KOA筛查、诊断的分子监测物质。由于KOA与多种因素调节相关，发病机制较复杂，miR-138、HIF-2α是否能单独适用于KOA筛查、诊断及评估复发风险的监测标志物还需深入进行研究。